液相色譜技術(shù)chromatography-文庫吧
2025-07-04 23:20 本頁面
【正文】 。 商品化的介質(zhì)均能滿足 14條的要求 。 介質(zhì)的類型： 1st Sephadex 2nd Sephacryl 3rd Superose/dex, Sepharose 4th Cellulose 5th TSKgel 凝膠介質(zhì)特征參數(shù) 排阻極限 (exclusion limit)：指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的 M。 如 ， Sephadex G50的排阻極限為 30kD。 分級范圍 (fractionation range)：能阻滯組分并且使組分相互之間得到分離的組分分子量范圍 。如 ， Sephadex G50的分級在 。 溶脹率 /吸水率： 如 ， Sephadex G50的溶脹率 = 500 177。 30%。 % 100干g e lg e l后g e l溶 脹WWW 干平衡吸水率 ??凝膠粒徑：軟 gel粒徑較大 ， 在 50150?m之間；硬gel較小 ， 在 550?m之間 。 粒徑越小 ， HETP越小 ，分離效率越高 。 床體積 (bed volume)： 1g干燥 gel溶脹后所占有的體積 。 如 ， Sephadex G50的床體積為 911 cm3/g干膠 。 空隙體積 (void volume)：凝膠之間的空隙體積 ，即 V0。 空隙體積一般用平均分子量在 2022KD水溶性藍(lán)葡聚糖 (blue dextran)測定 。 tVV ??04)影響 GFC分離特性的因素 線速度： 1st HW40F凝膠的排阻極限小 ， 在該凝膠中蛋白質(zhì)的 m = 0， 故HETP = 2Dz/u (Dz ? udp) = 常數(shù) 。 2nd HW55F凝膠的排阻極限較大 ，在此 ， m 0, HETP ? u。 在 u = 0處 ， 直線交于點(diǎn) 2Dz/u。 3rd 當(dāng) u cm/min, NaCl的HETP隨流速降低急劇增大 。 這主要由于分子的擴(kuò)散影響 。 CuBuAHE T PH ???)(進(jìn)樣體積： 1st 在一定相對料液體積范圍內(nèi) ，HETP為常數(shù)； 2nd 但一定時間之后 ， HETP隨料液相對體積的增加而急劇增大 。 3rd 意義：為得到較高的分離度 ， 料液體積需根據(jù)溶質(zhì)的 m差別控制在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi) ， 在不影響分離度的前提下取最大值 。 料液濃度 依據(jù) GFC的原理 ， tr和 HETP與濃度無關(guān) 。 但實驗表明 ， 當(dāng)濃度較高時 ，洗脫曲線出現(xiàn)吐舌 、 拖尾 、 甚至雙峰；使 HETP極度上升 。 這主要為樣品黏度高造成 。 經(jīng)驗表明 ， 料液與流動相的黏度比應(yīng)控制在 2以內(nèi) 。 分子量 M和分配系數(shù) m 1st 在 GFC分級范圍內(nèi) m與 M關(guān)系 此時 ， 分離度方程為 方程示： b值越大 ， 即凝膠分級范圍越小 ， Rs越大 。 2nd 因此 ， 一定料液時 ， 根據(jù)組分的 M選擇分級范圍較小的介質(zhì) ，提高 Rs和料液的處理量 。 Mbam log??? ?? ? ? ?? ? bDB u dAdFmMMFLRmpps 1212/1/14l o g???凝膠的粒徑 1st dp?, HETP?.故 dp?是 N?的最佳途徑； 2nd dp?10倍 , 而 h和 v不變 ， u?10倍 ， HETP(=hdp) ?10倍 ， R?10倍 ? ?? ? ???????11302)(22FmFmFDuduDH E T PHepz5） 應(yīng)用 1st 分離純化 M： x0106， d: ； 種類：肽 、 脂質(zhì) 、 抗生素 、 糖 、 核酸 、 病毒 (50400nm)。 2nd 除熱原 、 過敏原 如青霉噻唑蛋白 – Sephadex G25凝膠柱 。 3rd脫鹽 /置換 buffer 4th M測定 原理： 挑 選 標(biāo) 準(zhǔn) 蛋 白 質(zhì) ： cyt C(12500), Mb(16900), 胰凝乳蛋白 (23200),卵白蛋白 (45000)和 Hb(64500). 條件：在凝膠介質(zhì)分級范圍內(nèi) . 作圖： Mbam log??6） 優(yōu)點(diǎn) ? 1st 如其他色譜相比 ， 操作簡便 ， 介質(zhì)價廉易得；適合于大規(guī)模生產(chǎn)； ? 2nd 溶質(zhì)和介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，故操作條件溫和，回收率接近 100%； ? 3rd 分離結(jié)束后，無須對分離介質(zhì)進(jìn)行清洗和再生，故容易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度； ? 4th 作為脫鹽手段， GFC比透析法速度快，精度高；與超濾相比，剪切力小，蛋白質(zhì)的回收率高。 ? 5th 分離機(jī)理簡單，操作參數(shù)少，易于放大。 7）缺點(diǎn) ? 1st 分離僅限于分子量的差別，選擇性低，處理量少； ? 2nd 經(jīng) GFC洗脫后，產(chǎn)品被稀釋。因此需濃縮單元操作。 離子交換色譜 ? 以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法 原理 (ion exchanger chromatography, IEC) 1st 荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù) m I離子強(qiáng)度； A和 B為常數(shù) , 均為 pH的函數(shù) ， 在物理意義上 ， B為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)與交換劑的離子價數(shù)之比 (對于 pro,一般大于 10)。 m?離子強(qiáng)度無限大時的溶質(zhì)分配系數(shù) , 為靜電作用外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在交換劑上分配 。 2nd 意義： 對于 aa 調(diào)節(jié) I value 調(diào)節(jié) |pH – pI| value ??? mIAImB)(常用的離子交換樹脂 ? 葡聚糖凝膠型 DEAESephadex A25， QAESephadex A25， CMSephadex C25， SPSephadex C25 ? 纖維素系列離子交換劑 DE
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