【正文】 蠟盤中放固體氫氧化鈉，吸附盤中的 CO2，以防產(chǎn)生碳酸鉛沉淀），用毛細(xì)吸管吸取檸檬酸鉛染液，逐一滴加在每一銅網(wǎng)上，再翻轉(zhuǎn)銅網(wǎng)，使其切片面向下并飄浮于滴液之上，蓋好蠟盤。染色時(shí)間為 15分鐘，而后逐一取出銅網(wǎng)，經(jīng)蒸餾水清洗三次后，用濾紙吸去水分待干燥即可電鏡觀察。 第八節(jié) 冷凍超薄切片技術(shù) 冷凍超薄切片技術(shù)始于 1952年，它的特點(diǎn)是用新鮮的材料直接冷凍固定，無需再進(jìn)行脫水、滲透、包埋、聚合等一系列繁瑣的程序。但要在冷凍固定之前進(jìn)行預(yù)固定和冷凍保護(hù)處理，然后用冷凍超薄切片機(jī)切片。 與普通超薄切片比，冷凍切片的樣品更富真實(shí)性，它不會(huì)因?yàn)槊撍鴵p失某些成分，也不會(huì)與包埋劑發(fā)生某種化學(xué)反應(yīng)，更不會(huì)因?yàn)闊峋酆隙蛊涑⒔Y(jié)構(gòu)變形。難點(diǎn)是在樣品制備過程中易造成冷凍損傷和干燥損傷等，大大降低樣品的實(shí)用價(jià)值。為此人們先后研究了多種冷凍保護(hù)劑，并提出了用甲基纖維素處理防止干燥損傷的方法。 一、冷凍超薄切片機(jī) 冷凍超薄切片機(jī)適用于多種類型的材料，總的包括非生物材料和生物材料兩大類。 二、冷凍超薄切片樣品的制備 一般冷凍超薄切片樣品的制備包括取材、冷凍保護(hù)、冷凍固定、冷凍超薄切片、冷凍干燥、免疫標(biāo)記或染色等技術(shù)。 組織材料 預(yù)固定和 冷凍保護(hù) 冷凍 固定 冷凍 超切 免疫標(biāo)記 冷凍干燥 電子染色 透射電鏡觀察 ? 冰晶損傷是冷凍樣品制備技術(shù)最容易產(chǎn)生的缺陷。冰晶損傷是由樣品中的游離態(tài)水分凍結(jié)而造成的一種樣品結(jié)構(gòu)的損傷，它主要是由于冷凍速率不足引起的。最佳冷凍效果是冷凍速率足夠高（ 1000C/s），冷凍溫度足夠低（ 160℃ ），使細(xì)胞中的游離態(tài)水迅速形成無定形態(tài)冰（玻璃態(tài)冰），而細(xì)胞中與蛋白質(zhì)或脂肪結(jié)合的結(jié)合態(tài)水卻不結(jié)冰。 ? 防止冰晶損傷，可以使用優(yōu)質(zhì)冷凍保護(hù)劑，最佳冷凍裝置，樣品塊不宜過大，另外還可以在冷凍之前對(duì)樣品進(jìn)行冷凍保護(hù)處理。 ? 生物樣品做冷凍超薄切片的取材原則是“快”和“準(zhǔn)” ,樣品越新鮮越好。一般組織的含水量越高，所需冷凍保護(hù)劑的濃度也越高。冷凍保護(hù)的原理是用高濃度的冷凍保護(hù)劑處理生物樣品后，樣品中所含的游離態(tài)水與冷凍保護(hù)劑結(jié)合，使樣品中液體的濃度提高，與此同時(shí)就降低了樣品的冷凍點(diǎn)，這與鹽水不易凍結(jié)的道理一樣，其結(jié)果是防止樣品中形成冰晶。 ? 有時(shí)還可在冷凍保護(hù)之前先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)固定，以提高樣品結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。常用醛類作固定劑，如戊二醛、多聚甲醛、丙烯醛等。 ? 為提高冷凍固定的質(zhì)量，可先選用金屬鏡冷凍固定法，使樣品的表面平整，再于低溫條件下，用預(yù)冷的修塊刀將樣品頭部整修出一個(gè)小平原，面積約 ，然后再進(jìn)一步冷凍固定。如果樣品需要預(yù)固定，則可以在預(yù)固定的過程中，用鋒利的刀片將樣品的頭部切成方形或梯形，冷凍固定是注意把修好的那面調(diào)節(jié)到切片的位置上，使切片平整且大小適宜。 ? 冷凍固定的關(guān)鍵是快速優(yōu)質(zhì)。目前常用的有 KF80、 金屬鏡和 MM80E金屬鏡冷凍固定裝置等。 ? 完成冷凍固定之后，就能把樣品裝入冷凍超薄切片機(jī)進(jìn)行切片了。在轉(zhuǎn)運(yùn)樣品的過程中要使其始終浸沒在液氮中。要事先打開冷凍超薄切片機(jī)，預(yù)冷到所需溫度。要在切片之前冷卻刀。 ? 根據(jù)研究目的的不同選擇切片時(shí)樣品的溫度，－ 50℃ ～－ 190 ℃ 。一般刀的溫度比樣品的溫度相應(yīng)高 10～ 20 ℃ 。切片速度小于 ，厚度 70～ 100nm。 ? 切片的收集有液滴沾取法、睫毛筆撥取法、漂浮撈取法等。 ? 切片的染色要根據(jù)研究目的進(jìn)行選擇，如：一般研究超微結(jié)構(gòu)，可選負(fù)染色法；做免疫電鏡，需要進(jìn)行免疫標(biāo)記，還有正染色等其它染色方法。 第二章 負(fù)染色技術(shù) 負(fù)染色技術(shù)首先由 Hall（ 1955）等人所采用，在后來的生物學(xué)研究中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。負(fù)染色樣品不需經(jīng)過固定、脫水、包埋和超薄切片等復(fù)雜操作，而是直接對(duì)沉降的樣品勻漿懸浮液進(jìn)行染色。與超薄切片技術(shù)相比，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、用藥量極少、省時(shí)快速及分辨力高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛用于細(xì)菌、病毒、大分子結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞碎片及分離的細(xì)胞器等研究工作。特別是在病毒學(xué)領(lǐng)域，負(fù)染色更能發(fā)揮其獨(dú)到作用，是一項(xiàng)很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 組織超薄切片的染色通常稱為正染色。在正染色時(shí)，重金屬離子與大分子反應(yīng)增加了樣品結(jié)構(gòu)的電子密度，使之在電鏡下觀察時(shí)呈黑色，但背底 未被染色，觀察時(shí)呈白色，從而形成樣品圖像反差。 負(fù)染色又稱陰性反差染色，它是利用高密度的、且在透射電鏡下又不顯示結(jié)構(gòu)的重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸鈾等），把生物標(biāo)本包圍起來、在黑暗的背景上顯示出呈現(xiàn)陰性反差樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。所以負(fù)染色所顯示的電鏡圖像，正好與超薄切片正染色相反，其樣品結(jié)構(gòu)為透明淺色，而背底則為無結(jié)構(gòu)的灰色或黑色。對(duì)于負(fù)染色的機(jī)制，目前還不夠清楚。在負(fù)染色中，樣品與染液之間不發(fā)生反應(yīng)，只是利用樣品染色劑密度的懸殊對(duì)比而將樣品襯托出來，故稱負(fù)染色法。 凡密度比生物樣品大 4倍以上的重金屬鹽類均可作為負(fù)染色劑。最常用的有磷鎢酸（ PTA）、磷鎢酸鉀（ KPT）、磷鎢酸鈉（ NaPT）、醋酸鈾、甲酸鈾和鉬酸銨等。 當(dāng)使用磷鎢酸或磷鎢酸鹽時(shí)，可用蒸餾水配制成 1％～ 3％的溶液，染色前應(yīng)用 1N的氫氧化鈉或氫氧化鉀將 pH值調(diào)到 ～ ，可保存在室溫下，相當(dāng)穩(wěn)定。 醋酸鈾則用 ~1％水溶液， pH為 ～ ，反差較強(qiáng)，對(duì)樣品的破壞作用小。染液在用前新鮮配制。 鉬酸銨配制成 1～ 2％的水溶液，使用時(shí)用 HCL將 pH調(diào)至 ～ 間。 作為負(fù)染色劑的條件：（ 1）具有較高的電子密度和較強(qiáng)的電子散射能力；（ 2）耐受電子束的轟擊、在電子束照射下不升華；（ 3）在電鏡下不呈現(xiàn)染色劑本身的結(jié)構(gòu)；（ 4）化學(xué)穩(wěn)定性好，不析出沉淀，與樣品不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，易在不規(guī)則樣品表面滲透。 第一節(jié) 染液種類及其特性 第二節(jié) 負(fù)染樣品的制備 負(fù)染色所用的樣品，全部取自懸浮液。在這種懸浮液中樣品必須達(dá)到一定的濃度和純度，這樣才能與染色劑之間產(chǎn)生特異和清晰的結(jié)合反應(yīng)。操作時(shí)，將帶有樣品的懸液，滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上，染色處理后即可進(jìn)行電鏡觀察。 一、取樣方式 ? ? 某些病毒性皰疹，如天花、水痘及皰疹等，可用毛細(xì)吸管直接刺入皰疹中取樣。感染病毒的植物組織可采取將葉或莖切開，將液汁直接滴到帶有支持膜載網(wǎng)上。生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上的微生物，可先用鉑金環(huán)將其刮下，然后用緩沖生理鹽水將刮下的微生物稀釋成適當(dāng)濃度的懸液，即可進(jìn)行滴樣。 ? ? 用于細(xì)菌 、 病毒 、 噬菌體等微生物或細(xì)胞勻漿中線粒體 、 微管等細(xì)胞器的提純 。 先用低速離心 （ 3000轉(zhuǎn)／分 ） ， 棄去較大雜質(zhì)和細(xì)胞碎片 ， 再用適當(dāng)孔徑的濾膜過濾 ， 其濾液再經(jīng)低溫超速離心 ， 最后取沉淀物制成懸液滴樣染色 。 ? ? 若提高電鏡下觀察病毒的效果，除了要求所觀察病毒有較高純度外，還要使其有適當(dāng)濃度。為此，需對(duì)病毒樣品進(jìn)行濃縮，采用方法通常有以下幾種： ? （ 1） ． 紅細(xì)胞吸附法 主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制備 。其操作方法為：將病毒懸液與等量紅細(xì)胞混合 ， 放置 5分鐘 ， 使病毒吸附于紅細(xì)胞表面；而后 ， 以 800轉(zhuǎn)／分速度低速離心 15分鐘 ，使吸附有大量病毒的紅細(xì)胞沉于管底；最后 ， 棄去上清液 ， 加入少量生理鹽水 ， 于室溫下或冰箱中存放 3～ 4小時(shí) ， 病毒即可從紅細(xì)胞表面釋放到上面的溶液里 ， 取溶液滴在銅網(wǎng)載膜上 ， 進(jìn)行后染色處理 。 ? （ 2） ． 低滲釋放法 從培養(yǎng)瓶中刮下所培養(yǎng)的腺病毒或皰疹病毒 ，低速離心 ， 棄上清液 ， 于沉淀物中加入培養(yǎng)液與蒸餾水的混合液（ 比例為 1:4） ， 使細(xì)胞因低滲破裂而釋放出病毒 ， 然后快速凍融數(shù)次 ， 再將凍融后的懸液低速離心 ， 取其上清液滴膜染色 。 ? （ 3） ． 抗體一病毒凝集沉淀法 某些病毒如鼻病毒 、 風(fēng)疹病毒 、 小兒腹瀉輪狀病毒及甲 、 乙型肝炎抗原等 ， 可與相應(yīng)的抗體形成病毒一抗體復(fù)合物 ， 經(jīng)離心沉淀而濃縮 ， 而后取濃縮的沉淀物滴膜染色 ， 可找到較多的病毒 。 目前這一技術(shù)已廣泛用于病毒疾病的快速診斷 。 二、支持膜 ? 在電鏡下觀察負(fù)染色樣品，如需放大倍數(shù)較高，即在高倍下才能觀察到樣品結(jié)構(gòu)時(shí)，應(yīng)該用大約 510nm厚的碳膜或微篩膜。當(dāng)不需要很高倍數(shù)時(shí)，也可采用在方華膜上噴碳方法制成支持膜，厚度不應(yīng)超過 30nm。 第三節(jié) 負(fù)染色操作方法 一、滴染法 將制備好的懸浮液樣品 ， 用毛細(xì)吸管吸取 ， 滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上 。 根據(jù)懸液內(nèi)樣品的濃度 ， 立即或放置數(shù)分鐘后 ， 用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體 ， 即可滴上染液 ，染色時(shí)間 1～ 2分鐘 。 而后即可用濾紙吸去染液 ， 待干燥后即可電鏡觀察 。 注意事項(xiàng)： （ 1） 操作時(shí)吸管不能離銅網(wǎng)太近 ， 應(yīng)讓液滴離開吸管后自然滴下 ， 否則液滴易將銅網(wǎng)吸起； （ 2） 支持膜應(yīng)完好無損 ， 吸管不能太粗 ， 液滴不能太大 ， 否則都不能形成良好的液珠； （ 3） 病毒的邊緣分布較多 ， 操作時(shí)不宜用濾紙吸干 ， 而任其自然稍干后再加染液 。 二 、 漂浮法 先將樣品懸浮液滴在干燥的載玻片上 ， 再把帶有支持膜的銅網(wǎng)放在懸浮液的液珠上漂浮以沾取樣品：然后 ， 用濾紙吸干銅網(wǎng)上的多余懸液 ， 再將銅網(wǎng)在染液滴珠漂浮 ， 時(shí)間 1－ 2分鐘 ， 最后再用濾紙將染液吸干即可觀察 。 第四節(jié) 影響負(fù)染效果的有關(guān)因素 一 、 掌握染色時(shí)機(jī) ? 染色應(yīng)在銅網(wǎng)上的懸液將要干燥而又沒完全干燥時(shí)進(jìn)行 ， 如果銅網(wǎng)上的懸液殘留較多或完全干燥后染色 ， 則嚴(yán)童影響染色效果 ， 便得不到理想的負(fù)染電鏡圖像 。 二 、 控制 pH值 ? 懸浮液與染液的 pH值對(duì)負(fù)染效果有著明顯影響 ， 一般應(yīng)使懸液呈中性或略偏酸性為宜 （ ～ ） 。 為了確保懸液有足夠的緩沖條件 ， 多采用 2％ 醋酸銨 、 碳酸銨溶液或其他緩沖液作為懸浮樣品的稀釋液 。 ? 特別是磷鎢酸染液的 pH對(duì)病毒染色的影響更為顯著 ， 較酸的染液對(duì)病毒負(fù)染可產(chǎn)生較好的效果 ， 而染液越是偏堿 ， 其染色效果越差 。 染液的酸堿度不僅可影響染液的擴(kuò)散 ， 而且也會(huì)影響到病毒的結(jié)構(gòu) 。 三 、 樣品的純度和濃度 ? 樣品的純度和濃度對(duì)負(fù)染均有明顯影響 ， 如果負(fù)染樣品含雜質(zhì)太多 （ 如大量的細(xì)胞碎片 、 培養(yǎng)基殘?jiān)胞}類結(jié)晶等 ） ， 會(huì)對(duì)負(fù)染色效果產(chǎn)生干擾 ， 因此 ， 樣品在負(fù)染前要適當(dāng)純化 。 此外 ， 懸液中的樣品濃度要適當(dāng) ， 濃度太稀時(shí) ，會(huì)造成電鏡下找不到樣品或?qū)ふ依щy；樣品太濃時(shí) ， 會(huì)造成樣品堆積而影響觀察 ， 因此 ， 要求滴樣時(shí)應(yīng)做各種稀釋度的對(duì)比觀察 。 四 、 樣品的均勻分散性 ? 在進(jìn)行負(fù)染時(shí) ， 經(jīng)常發(fā)生顆粒懸浮樣品的凝集現(xiàn)像 。 此時(shí) ， 染色劑與樣品形成電子不能穿過的團(tuán)塊 ， 致使無法看清樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu) 。 造成上述現(xiàn)象的主要原因 ， 是懸浮樣品不易在銅網(wǎng)上展開而形成的一種團(tuán)聚現(xiàn)象 。 ? 為了促進(jìn)懸浮樣品的均勻分散性 ， 以提高負(fù)染色效果 ， 現(xiàn)在多采用分散劑或濕潤(rùn)劑 ， 這種物質(zhì)可以促使顆料性懸液在銅網(wǎng)上擴(kuò)散 。 常用的有牛血清肉蛋白 （ BSA） 、 桿菌肽 、 二甲基亞砜（ DMSO） 、 甘油丙二醇 、 十八 （ 碳 ） 烷等 。 其中 ， 牛血清白蛋白配成 ～ %的濃度 ， 以 3～ 4滴為宜 ，或直接用 %的 BSA作為離心沉淀物的稀釋液 。 桿菌肽配成30～ 50μ g／ ml水溶液 ， 用于稀釋沉淀的顆粒標(biāo)本 ， 或按適當(dāng)比例加入懸浮樣品內(nèi) 。 l％ 二甲基亞砜溶液加入染液中 ， 具有加強(qiáng)染液穿透力和擴(kuò)散作用 。 五 、 負(fù)染樣品的電鏡觀察條件 ? 1． 負(fù)染色生物樣品作電鏡觀察時(shí) ， 應(yīng)選用最小物鏡光闌孔（ 20～ 30μ m） ， 以增大樣品的反差 。 ? 2． 電鏡的加速電壓 ， 一般可提高一些 ， 以增加電子的穿透能力和分辨力 。 但有時(shí)提高電鏡的加速電壓反而會(huì)降低圖像的反差 ， 使分辨力降低 ， 因此應(yīng)靈活掌握 。 ? 3．對(duì)負(fù)染樣品應(yīng)采取快速觀察快速照像的方法進(jìn)行，一般在 3～ 4萬倍的放大倍率下，即可獲得反差良好。自然柔和、高分辨的電鏡圖像。電鏡觀察時(shí)要盡量避免長(zhǎng)時(shí)間照射樣品，以免引起樣品的損壞。 第三章 其他電鏡技術(shù) 電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是將細(xì)胞化學(xué)和電鏡技術(shù)相結(jié)合用于細(xì)胞組織學(xué)研究的一項(xiàng)技術(shù)，亦稱為電鏡組織化學(xué)技術(shù)。它是普通光鏡組織化學(xué)技術(shù)在電鏡水平上的發(fā)展和應(yīng)用，使組織化學(xué)研究從顯微結(jié)構(gòu)水平發(fā)展到超顯微結(jié)構(gòu)水平。 目前 ， 了解細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的生物化學(xué)功能的方法 ， 大體可分兩類 ，一類是將組織細(xì)胞分為許多亞細(xì)胞成分 ， 在研究這些成分的生化活性的同時(shí) ， 用電鏡進(jìn)行純形態(tài)的觀察 ， 再將生化活性的研究與微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察間接地聯(lián)系起來；另一類是在盡量保存細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的同時(shí) ， 在原位直接