【正文】 切小后，立即浸到大量固定液中。 ? 在化學(xué)固定過(guò)程中，組織微細(xì)結(jié)構(gòu)保存的質(zhì)量不僅受到固定液特性的影響，而且還受到固定組織所使用方法的影響。 它能和細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì) ， 主要是蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)結(jié)合形成交聯(lián) ， 使蛋白成分得以凝固穩(wěn)定 ，與此同時(shí)也能保存糖類(lèi)和脂肪 ， 使其保持生活時(shí)的狀態(tài)和位置 ，從而達(dá)到把細(xì)胞的精細(xì)形態(tài)結(jié)構(gòu)保存下來(lái)的目的 。 ? 化學(xué)固定法 是采用一定的化學(xué)試劑對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行固定 。 固定的目的：防止組織細(xì)胞的離體后變化 ， 防止自溶 ， 以保持組織細(xì)胞的成分和結(jié)構(gòu)與其生活狀態(tài)盡量一致 在固定以后的漂洗 、 脫水和包埋等樣品處理過(guò)程中 ， 保護(hù)樣品使其物質(zhì)不致溶解和流失 為以后樣品的處理 （ 包括染色和經(jīng)受電子束轟擊 ） 作準(zhǔn)備 ， 并使組織適當(dāng)?shù)赜不? （一）、固定方法 ? 物理固定法 是指用冷 、 熱或微波等物理方法對(duì)生物組織進(jìn)行固定 。用鋒利鋸條將骨組織鋸成約 3mm碎骨片，放入固定液中固定過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間，緩沖液漂洗后放入脫鈣液中脫鈣約 3周后再切成小塊。對(duì)于田間植物材料，還可以采集植株保濕帶回實(shí)驗(yàn)室，再進(jìn)行取材。將含有細(xì)胞的固定液轉(zhuǎn)移到離心管中，低速離心 1020分鐘，使細(xì)胞聚成團(tuán)塊，用擦鏡紙包好細(xì)胞團(tuán)塊，置于新鮮的固定液中固定。 表面有毛刺的植物材料 ， 需先用酶處理使之軟化 ， 表面有蠟質(zhì)的葉片在 50%乙醇溶液中浸泡幾秒至幾十秒進(jìn)行脫蠟 ， 取出后用雙蒸水清洗數(shù)次 ， 再切取 。 一般植物葉片常切成寬1mm、 長(zhǎng) 34mm的小條 。 對(duì)于某些特殊材料 ， 如神經(jīng)組織等 ， 應(yīng)先進(jìn)行原位固定或灌流固定 ， 待組織適度硬化后再取材 。 取材方法： 1） 動(dòng)物：將動(dòng)物麻醉或急性處死 ， 在 12分鐘內(nèi)解剖出所需要的組織器官 ， 用鋒利的解剖刀取小塊材料 ， 迅速投入冷的戊二醛固定液中 。 樣品過(guò)大時(shí)內(nèi)部固定不良 ， 過(guò)小時(shí)觀察的目標(biāo)又會(huì)受到局限 。 “ 輕 ” ：所謂 “ 輕 ” ， 是指一切操作都應(yīng)始終貫徹動(dòng)作輕柔 ， 不僅要避免對(duì)組織的擠壓及鉗拉 ， 還要注意器械的鋒利 ， 否則將引起組織結(jié)構(gòu)的人工損傷性變化 。 尤其在暑熱情況下 ， 還會(huì)出現(xiàn)微生物繁殖導(dǎo)致樣品腐敗 ， 細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu)當(dāng)然會(huì)全部破壞 。 ? 所需器材有吸管、封口膜、稱量瓶、燒杯、雙面刀片和醫(yī)用剪刀、鑷子、牙簽、解剖鏡等 . ―快 ” ：不管是從麻醉或處死動(dòng)物身上取材 ， 還是臨床手術(shù)取材 ， 都應(yīng)注意保持樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu) ， 使其最大限度的近于生活狀態(tài) 。 ? 定義：從動(dòng)植物機(jī)體上或從細(xì)胞及微生物的培養(yǎng)物中取得所需材料的操作過(guò)程。 二 實(shí)驗(yàn)器具和實(shí)驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備 ? 要考慮到各個(gè)環(huán)節(jié)所需要的玻璃器皿、實(shí)驗(yàn)器材以及實(shí)驗(yàn)試劑等。如在細(xì)胞化學(xué)工作中，一般 要求選用二甲砷酸鹽緩沖液，一些特定的離子細(xì)胞化學(xué)技術(shù)需要特定的緩沖液。 ? 應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行一般的超微結(jié)構(gòu)觀察還是進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)或免疫電鏡觀察，實(shí)驗(yàn)涉及的是哪些組織和器官，對(duì)取材的組織和器官的部位都要考慮周密。每一步都關(guān)系到實(shí)驗(yàn)成功與否，需步步謹(jǐn)慎認(rèn)真。 第一節(jié) 普通超薄切片技術(shù) 普通超薄切片技術(shù)：不需要特殊的冷凍條件的常規(guī)包埋切片技術(shù)。 復(fù)型膜制備和樣品負(fù)染色的實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單 、 易于操作 ， 而制備超薄切片的過(guò)程則比較繁雜 。 透射電鏡靠電子束穿透樣品成像 ，對(duì)樣品厚度有很高要求 。 ? 掃描隧道顯微技術(shù) (STM) ? 原子力顯微技術(shù) (AFM) ? 激光掃描共焦顯微技術(shù) 利用共焦光路及激光掃描，在觀察較厚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)或直接觀察細(xì)胞時(shí)，可使所選定的不同層面每一焦點(diǎn)面影象清晰，從而得到細(xì)胞不同切面上的一系列圖象，經(jīng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)快速分析處理，即可重組出樣品三維立體圖象，展現(xiàn)細(xì)胞瞬間變化的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 其分辨率可與透射電鏡相比擬。 ? 掃描隧道顯微技術(shù) (STM) ? 原子力顯微技術(shù) (AFM) ? 激光掃描共焦顯微技術(shù) 通過(guò)微懸臂上的針尖在樣品表面掃描，使針尖與凹凸不平的樣品表面的頂端原子相互摩擦產(chǎn)生原子力。 具有原子尺度的高分辨率。利用電鏡技術(shù)觀察高分子、表面活性劑、碳納米管及納米粒子等結(jié)構(gòu)形態(tài)，為化學(xué)及材料科學(xué)研究提供了有力的技術(shù)手段。 ? 利用多種樣品制備方法和高性能的電子顯微鏡，在生命科學(xué)領(lǐng)域可以觀察到細(xì)胞中各種細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)，并以此進(jìn)一步研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，深入探索細(xì)胞通訊與運(yùn)輸、分裂與分化、增殖與調(diào)控等生命活動(dòng)的規(guī)律。 電子顯微鏡結(jié)構(gòu)的改進(jìn)和功能的改善，樣品制備技術(shù)的改進(jìn)，使電子顯微鏡技術(shù)在生命科學(xué)研究中發(fā)揮了重要作用。 電鏡廠家：日本日立（ Hitachi）公司 日本電子光學(xué)實(shí)驗(yàn)室（ JEOL) 荷蘭菲利浦公司（ Philips）（即美國(guó) FEI公司） 德國(guó)蔡司（ Zeiss）公司 捷克 英國(guó)劍橋 二、國(guó)內(nèi)電子顯微鏡生產(chǎn)簡(jiǎn)況 1959中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所研制成功第一臺(tái)透射電子顯微鏡 10萬(wàn)倍 100kv 重大科學(xué)技術(shù)成果 1975中國(guó)科學(xué)院北京科學(xué)儀器廠研制成功第一臺(tái)掃描電子顯微鏡 電鏡廠家：中國(guó)科學(xué)院北京科學(xué)儀器廠研制中心 上海電子光學(xué)技術(shù)研究所 南京光學(xué)儀器廠 三、電子顯微鏡的發(fā)展 分辨率進(jìn)一步提高，點(diǎn)分辨率優(yōu)于 ，晶格分辨率 放大倍數(shù)從十幾倍提高到幾十萬(wàn)甚至百萬(wàn)倍 種類(lèi)不斷增加，功能不斷擴(kuò)展。 研制成功第一臺(tái)透射電子顯微鏡 研制成功第一臺(tái)掃描電子顯微鏡 生產(chǎn)了第一臺(tái)商品用的透射電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡作為商品問(wèn)世 研制成功第一臺(tái)透射電子顯微鏡 研制成功第一臺(tái)掃描電子顯微鏡 發(fā)明掃描隧道顯微鏡 主持研制成功首臺(tái)原子力顯微鏡 表 11 顯微鏡發(fā)展簡(jiǎn)史 電子顯微鏡之父 世界上第一臺(tái)電子顯微鏡 儀器名稱：透射電子顯微鏡 生產(chǎn)廠家：荷蘭 Philips公司 儀器型號(hào)： Teai 12 主要附件： Gatan 792 CCD 性能指標(biāo)： 最 大 放 大 倍 數(shù) ： 65 萬(wàn)倍 點(diǎn)分辨率： 線分辨率： 最高加速電壓： 120KV 一、國(guó)外電子顯微鏡生產(chǎn)簡(jiǎn)況 1932年德國(guó)物理學(xué)家 Knoll和 Ruska研制成功第一臺(tái)透射電子顯微鏡。 制造者 荷蘭眼鏡制造商 Janssen 英國(guó)科學(xué)家和發(fā)明家羅伯特 .胡克 荷蘭業(yè)余科學(xué)家列文 .虎克 德國(guó)物理學(xué)家 Knoll和 Ruska Ardenne 德國(guó) Siemens公司 英國(guó)劍橋科學(xué)儀器有限公司 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所 中國(guó)科學(xué)院北京科學(xué)儀器廠 瑞 士 科 學(xué) 家 Binnig 、 Rohrer 、Gerber和 Weible 中國(guó)科學(xué)院白春禮 年代 1590 1665 1665 1932 1938 1939 1965 1959 1975 1981 1990 顯微鏡 發(fā)明了放大 2030倍的復(fù)式光學(xué)顯微鏡 自制復(fù)式顯微鏡 。實(shí)用電子顯微鏡技術(shù) 測(cè)試中心 陳義芳 2021年 緒論 電子顯微鏡技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史 第一節(jié) 電子顯微鏡發(fā)展簡(jiǎn)史 第二節(jié) 電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用 第三節(jié) 其他顯微技術(shù)的發(fā)展 第一節(jié) 電子顯微鏡發(fā)展簡(jiǎn)史 電子顯微鏡通常分為透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡兩種類(lèi)型。利用電子顯微鏡可對(duì)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)及樣品表面形貌進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察與研究。 觀察軟木薄片 ， 第一次描述植物細(xì)胞結(jié)構(gòu) 利用小型高倍透鏡制成簡(jiǎn)單顯微鏡 ， 放大倍數(shù)達(dá) 300倍 ， 觀察動(dòng)植物活細(xì)胞與原生動(dòng)物 ， 第一次看到許多單細(xì)胞生物 。 20世紀(jì) 80年代末，商品透射電子顯微鏡普遍進(jìn)入市場(chǎng)。（ TEM、 SEM、 STEM、分析電子顯微鏡、高壓透射電子顯微鏡、低溫透射電子顯微鏡等） 計(jì)算機(jī)技術(shù)開(kāi)始用于電子顯微鏡 一、電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展 第一臺(tái)電子顯微鏡問(wèn)世后，面臨的首要問(wèn)題是如何將電子顯微鏡技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)及其他學(xué)科研究。 第二節(jié) 電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用 表 12 電子顯微鏡技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史 年代 1934 1946 1947 1949 1950 1952 1956 1953 1955 1956 1956 1958 1959 1961 1957 1963 1939 1939 1962 1971 1974 1977 1978 研究者 Marotn Williams和 Wyckoff Claude Latta和 Hartmann Palade Palade和 Siekevitz Porter和 Blum Moran Hall和 Huxley Luft Glauert Watson Moran Luff Steere Sabatini及同事 Kauschehe和 Ruska Horisberger Feldherr和 Marshal Faulk和 Taylor Romano及同事 Horisberger及同事 Rpth及 Bendayan 電子顯微鏡技術(shù) 發(fā)表了第一張生物組織茅膏菜屬植物葉切片的電子顯微圖 將金屬投影用于增加電鏡圖象反差 開(kāi)始使用鈾固定劑 甲基丙烯酸酯被用作包埋介質(zhì) 用玻璃刀進(jìn)行組織切片 將緩沖液與鋨酸混合 ， 作為組織固定液 用電子顯微鏡分析細(xì)胞碎片 介紹切片機(jī)和切片技術(shù) 使用鉆石刀進(jìn)行超薄切片 ， 并創(chuàng)立冷凍超薄切片術(shù) 以磷鎢酸為負(fù)染色劑觀察了灌木病毒及煙草花葉病毒的超微結(jié)構(gòu) 高錳酸鉀作為固定劑 環(huán)氧樹(shù)脂作為包埋介質(zhì) 介紹用重金屬鉛和鈾對(duì)組織切片進(jìn)行染色 采用冷凍置換技術(shù)制備生物樣品 介紹 Epon包埋介質(zhì) 開(kāi)始研究冷凍斷裂技術(shù) 用戊二醛作預(yù)固定液保存細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及活性 ， 進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)方面研究 對(duì)蛋白質(zhì)吸附于膠體金進(jìn)行探討 將蛋白質(zhì)吸附于膠體金方法用于掃描電子顯微鏡 膠體金顆粒作為一種示蹤物用于電子顯微技術(shù)研究 膠體金作為抗血清特異標(biāo)記物用于透射電子顯微鏡 首次制備蛋白質(zhì) A金復(fù)合物 建立了制備免疫球蛋白 金顆?；痉椒? 提出包埋后免疫金標(biāo)記技術(shù) 二、電子顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用 ? 樣品制備方法主要包括：超薄切片、負(fù)染色、金屬投影、冷凍復(fù)型、快速冷凍深度蝕刻技術(shù)、免疫電子顯微鏡術(shù)、掃描電鏡常規(guī)樣品制備及掃描電鏡冷凍斷裂技術(shù)等。在農(nóng)林科學(xué)方面，電鏡技術(shù)對(duì)植物各種疾病病因診斷與防治的研究越來(lái)越重要。 ? 掃描隧道顯微技術(shù) (STM) ? 原子力顯微技術(shù) (AFM) ? 激光掃描共焦顯微技術(shù) 第三節(jié) 其他顯微技術(shù)的發(fā)展 ? 掃描隧道顯微 技術(shù) (STM) ? 原子力顯微技術(shù) (AFM) ? 激光掃描共焦顯微技術(shù) 利用量子力學(xué)中隧道效應(yīng)產(chǎn)生隧道電流信號(hào)，獲得反映樣品表面原子形態(tài)結(jié)構(gòu)和原子排列圖象。 可以觀察單原子層的實(shí)時(shí)結(jié)構(gòu)圖象，并能在大氣、真空甚至液體環(huán)境中觀察自然狀態(tài)下的樣品表面結(jié)構(gòu)，因而在半導(dǎo)體、金屬、無(wú)機(jī)材料及生物學(xué)研究等方面有廣闊的應(yīng)用前景。在掃描過(guò)程中，微懸臂的上下起伏與等位面的樣品形貌相互對(duì)應(yīng)，所以可通過(guò)針尖與微懸臂之間的隧道電流變化，得到樣品表面形貌信息。 AFM不但能通過(guò)探測(cè)原子間作用力觀察絕緣體，還可在生物環(huán)境中直接觀察生物樣品表面結(jié)構(gòu)。 第一章 超薄切片 技術(shù) 透射電鏡的生物樣品制備的常用方法包括超薄切片 、冷凍復(fù)型 、 負(fù)染色等 。 超薄切片方法得到的樣品切片厚度為 60100nm， 冷凍復(fù)型膜厚度約為 30nm。 它分為普通超薄切片技術(shù)和冷凍超薄切片技術(shù)兩大類(lèi) 。 包括：取材、固定、清洗、脫水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等步驟。 具體步驟： 取材 ——醛類(lèi)固定液前固定幾小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間 ——洗數(shù)次 ——1%鋨酸后固定 2h或過(guò)夜 —— ——梯度乙醇或丙酮脫水（ 30％、 50％、 70％、 80％、 90％、 95％、100％、 100％） ——浸透（ 1： 1： 純包埋劑） ——包埋 ——聚合（ 37℃ 12h、 60℃ 48h） ——超薄切片 ——染色（雙重染色） 對(duì)超薄切片的基本要求