dna和cdna文庫構(gòu)建-資料下載頁
2025-05-09 02:59本頁面
【正文】 ，最準(zhǔn)確和可靠的鑒定方法 五、克隆基因的驗(yàn)證和分析 ? 根據(jù)載體選擇保存文庫的方法 ? 文庫陣列法（ 無菌培養(yǎng)板 ）保存大片段 DNA文庫 ? 長(zhǎng)期保存需在 80℃ 下進(jìn)行 ? 避免文庫的反復(fù)凍溶 六、 DNA文庫的保存 基因組 DNA文庫與 cDNA文庫的比較 ? 1） cDNA文庫所包含的遺傳信息要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于基因組DNA文庫，并且受細(xì)胞來源或發(fā)育時(shí)期的影響。 ? 2） cDNA文庫雖能反映 mRNA的分子結(jié)構(gòu)和功能信息，但不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息。 ? 3）在 cDNA文庫中，相應(yīng)于高豐度 mRNA的 cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而相應(yīng)于低豐度 mRNA的 cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。 七、目的基因的克隆 基因工程或 DNA重組技術(shù)的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因。目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。 目的基因的克隆戰(zhàn)略： 構(gòu)建感興趣生物個(gè)體的基因組文庫（ 鳥槍法克隆目的基因、 cDNA法克隆目的基因） 利用 PCR擴(kuò)增 化學(xué)合成 鳥槍法克隆目的基因的局限性 工作量較大；不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu) 鳥槍法操作的改進(jìn) 在連接前將 DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離 例如，已知某目的基因位于 kb的 SalI片段中，將染色體 DNA用 SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收 DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接。 kb kb kb cDNA法 寡聚 dT, 32PdNTP 32P標(biāo)記的 cDNA探針 雜交，顯影 寡聚 dT, 32PdNTP 32P標(biāo)記的 cDNA探針 雜交，顯影 對(duì)照材料 處理材料 分離 polyA mRNA 分離 polyA mRNA 構(gòu)建 cDNA文庫 從原平板克隆中分離 cDNA 差示雜交篩選克隆新基因 PCR法 使用 PCR法克隆目的基因的前提條件是： 已知待擴(kuò)增目的基因或 DNA片段的部分序列， 根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。 克隆程序： A/T克隆 化學(xué)合成法 全基因合成 上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成 DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對(duì)較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個(gè)單體的產(chǎn)物收率為 95%則合成 50個(gè)堿基長(zhǎng)的DNA單鏈大片段的總收率只有 %。
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