【正文】 基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。筆者認為引物設(shè)計軟件 的最佳搭配是 “Oligo”和 “Premier”軟件合并使用，以 “Premier”進行自動搜索， “Oligo” 進行分析評價，如此可快速設(shè)計出成功率很高的引物。 Primer Premier 的使用技巧簡介 1. 功能 “Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計 ( )、 限制性內(nèi)切酶位點分析 ( )和 DNA 基元 (motif)查找 ( )。 “Premier”還具有同源 性分析功能（ ），但并非其特長，在此略過。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中 最重要的是設(shè)計簡并引物，另外還 有序列 “朗讀 ”、 DNA 與蛋白序列的互換（ ）、 語音提示鍵盤輸入（ ）等等。 有時需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到 DNA 來設(shè)計引物，由于大多數(shù)氨基酸（ 20 種常見 結(jié)構(gòu)氨基酸中的 18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推 DNA 序列時，會 遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計并合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列 組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡并引物。遺傳密碼規(guī)則因物種或細胞亞 結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。 “Premier”可以針對 模 板 DNA 的來源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換 DNA 和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié) 構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（ Ciliate Macronuclear）、無脊椎動物線粒 體（ Invertebrate Mitochondrion）、支原體（ Mycoplasma）、植物線粒體（ Plant Mitochondrion）、 原生動物線粒體（ Protozoan Mitochondrion）、一般標(biāo)準（ Standard）、脊椎動物線粒體（ Vertebrate Mitochondrion）和酵母線粒體（ Yeast Mitochondrion）。 2. 使用步驟及技巧 “Premier”軟件啟動界面如下： 其主要功能在主界面上一目了然（按鈕功能如上述）。限制性酶切點分析及基元查找功 能比較簡單，點擊該功能按鈕后，選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶或基元（如 10 序列， 35 序列 等），按確定即可。常見的限制性內(nèi)切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新 限制性內(nèi)切酶或基元。 進行引物設(shè)計時，點擊按鈕，界面如下： 進一步點擊按鈕，出現(xiàn) “search criteria”窗口，有多 種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目 的（ Seach For）有三種選項， PCR 引物（ PCR Primers），測序引物（ Sequencing Primers）， 雜交探針（ Hybridization Probes）。搜索類型 (Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引 物（ Sense/Antisense Primer，或 Both），或者成對查找（ Pairs），或者分別以適合上、下游 引物為主（ Compatible with Sense/Antisense Primer）。另外還可改變選擇區(qū)域（ Search Ranges），引物長度（ Primer Length），選擇方式（ Search Mode），參數(shù)選擇（ Search Parameters） 等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項參數(shù)。如果沒有特殊要求，建議使用默認設(shè)置。然 后按，隨之出現(xiàn)的 Search Progress 窗口中顯示 Search Completed 時，再按，這時搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物（ Sense），下游引物 (Antisense)，成對顯示 (Pairs)。默認顯示為成對方式，并按優(yōu)劣次序（ Rating）排列，滿分為 100，即各指標(biāo)基本都能達標(biāo)（如下圖）。點擊其中一對引物，如第 1引物，并把上述窗口挪開或退出，顯示 “Peimer Premier”主窗口，如圖所示：該圖分三部分，最上面是圖示 PCR 模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（ Hairpin），二聚體（ Dimer），錯誤引發(fā)情況（ False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（ Cross Dimer）。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時，按鈕由變成，點擊該按鈕，在左下角的 窗口中就會出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾 給出該引物的最佳退火溫度，可參考應(yīng)用 .在需要對引物進行修飾編輯時，如在 5’端加入酶切位點，可點擊，然后修改引物序列。若要回到搜索結(jié)果中，則點擊按鈕。如果要設(shè)計簡并引物，只需根據(jù)源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī)則，反推至 DNA 序列即可。對簡并引物的分析不需像一般引物那樣嚴格?？傊?“Premier”有優(yōu)秀的引物自動搜索功能，同時可進行部分指標(biāo)的分析， 而且容易使用，是一個相當(dāng)不錯的軟件。 Oligo 使用技巧簡介 1. 功能 在專門的引物設(shè)計軟件中， “Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。 Oligo 的初始界面是兩個圖： Tm 圖和 ΔG 圖； Oligo 的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個圖，加了個 Frq 圖。 “Oligo”的功能比 “Premier”還要單一，就是引物 設(shè)計。但它的引物分析功能如此強大以至于能風(fēng)靡全世界。 2. 使用（以 Oligo 為例） Oligo 的啟 動界面如下： 圖中顯示的三個指標(biāo)分別為 Tm、 ΔG 和 Frq，其中 Frq 是 版本的新功能，為鄰近 6 至 7 個堿基組成的亞單位在一個指定數(shù)據(jù)庫文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。因為分析要涉及多個指標(biāo)，起動窗口的 cascade 排列方式不太方便，可從 windows 菜單改為 tili 方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標(biāo)，如 Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于 Oligo ，只是顯示更清楚了。 經(jīng)過 Windows/Tili 項后的顯示如圖： 在設(shè)計時，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列， 如果覺得合適，可點擊 Tm 圖塊上左 下角的 Upper 按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成 Lower。 amp。 8710 G 值反映了序列與模板的結(jié)合強度，最好引物的 amp。 8710 G 值在 5’端和中間值比較高，而在 3’端相對低（如圖：） Tm 值曲線以選取 72℃ 附近為佳， 5’到 3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。 Frq 曲線 為 “Oligo 6”新引進的一個指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機率大小。選取引物時，宜選用 3’端 Frq 值相對較低的片段。當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對引物進行評價并根據(jù)評價對引物進行修改。首先檢查引物二聚體尤其是 3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（ cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測（非克?。┬?PCR，對引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（ hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來說，這兩項結(jié)構(gòu)的能值以不超過 為好。當(dāng)然，在設(shè)計克隆目的的 PCR 引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會太低。這種 PCR 需要通過靈活調(diào)控退火溫度以達到最好效果，對引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測就不應(yīng)要求太高。第三項檢查為 GC 含量，以 4555％為宜。有一些模板本身的 GC 含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的 GC 含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，這時應(yīng)盡量使上下游引物的 GC 含量以及 Tm 值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果 PCR 的模板不是基因組 DNA，而是一個特定模板序列，那么最好還進行 False priming site 的檢測。這項檢查可以看出引物在非目的位點引發(fā) PCR 反應(yīng)的可能性。如果引物在錯配位點的引發(fā)效率比較高，就可能出假陽性的 PCR 結(jié)果。一般在錯配引發(fā)效率以不超過 100 為好，但對于特定的 模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為 450 以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為130，那么這對引物也是可以接受的。當(dāng)我們結(jié)束以上四項檢測，按 Alt+P 鍵彈出 PCR 窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、 Tm 值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和 簡單的評價。由于 “Oligo”軟件的引物自動搜索功能與 “Primer Premier 5”的相類似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再贅述。其實，使用軟件自動搜索引物就是讓計算機按照人的要求去尋找最佳引物，如果參數(shù)設(shè)置得當(dāng)將大大提高工作效率。除了本地引物設(shè)計軟件之外，現(xiàn)在還有一些網(wǎng)上引物設(shè)計軟件，如由Whitehead Institute 開發(fā)的 “Primer 3”等（本網(wǎng)站 已引進并調(diào)試好該軟件，歡迎使用）。該 軟件的獨特之處在于，對全基因組 PCR 的引物設(shè)計；可以將設(shè)計好的引物對后臺核酸數(shù)據(jù) 庫進行比對，發(fā)現(xiàn)并排除可引發(fā)錯配的引物。因此建議經(jīng)常做全基因組 PC