【文章內(nèi)容簡介】 10 pmol/μL的下游引物 mmol/L dNTPs混合物 無Mg2+緩沖液 25 mmol/L的MgCl2 5 U的TaqDNA聚合酶 雙蒸水補(bǔ)至25μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s；59℃退火 30 s； 共30個循環(huán)，72 ℃延伸 90 s；72 ℃延伸 10 min。 編碼tbpA的DNA部分片段的擴(kuò)增，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性 5 min。94 ℃變性 1 min； 50 ℃退火 1 min； 共30個循環(huán)72℃延伸 2 min；最后72 ℃延伸 10 min。 結(jié)果分析與判定 1％瓊脂糖凝膠板的制備稱取1 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。 加樣取6～8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2～3 μL加樣緩沖液和適量CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。 電泳電壓80～100 V，或電流40～50 mA，電泳30～40 min。 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或根據(jù)Marker判定大小與設(shè)計的大?。?20 kb）一致，則該樣品判定為陽性。5 診斷判定同份樣品在2個PCR中全部陽性的才可以判為本豬（群）已經(jīng)感染Hps，根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判定豬群是否發(fā)病。八、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）PCR檢測技術(shù)1 引用標(biāo)準(zhǔn)自定標(biāo)準(zhǔn)。2 范圍 適用于PRRS的PCR診斷。3材料 儀器：組織勻漿機(jī)；低溫臺式高速（12000 r/min）離心機(jī)；DNA擴(kuò)增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括1～20 μL 2支，20～200μL 1支，200～1000μL 1支；與移液器匹配的滴頭； mL離心管； mL（與擴(kuò)增儀配套）塑料管。 試劑 Trizol試劑 氯仿異丙醇 反轉(zhuǎn)錄酶MMLV（200 U/181。L） 75%乙醇 %焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液 mmol/L dNTP 10PCR Buffer 25 mmol/L MgCl2 10 pmol/L引物 50TAE（保存液）和1TAE（使用液） Loading Buffer 瓊脂糖 Oligo(dT)18（50 μmol/L） CYBgreen4 操作步驟 樣品采集取疑似豬的肺臟、淋巴結(jié)和脾臟病變部位組織，20 ℃保存?zhèn)溆谩?樣品處理取部分組織樣品， PBS（PH ~）稀釋成1: 5乳劑（或?qū)⒉×嫌眉舻都舫尚K，放入5 mL青霉素小瓶，進(jìn)一步剪碎， PBS后，用勻漿機(jī)勻漿），20℃保存?zhèn)溆没蛄⒓从糜赗NA提取。 RNA的提取a) 取處理好的稀釋樣品200~300 181。L，加入700 181。L TRIZOL試劑，渦懸混勻，在15~30 ℃溫育2~3 min；加入200 181。L的氯仿，蓋緊管蓋，上下顛倒混勻15 s，15~30℃溫育2~3 min，2~8 ℃ 12000 g離心15 min；b) 轉(zhuǎn)移水相500 181。L到一新的離心管中， mL的異丙醇，15~30℃作用10 min，2~8 ℃ 12000 g離心10 min；c) 棄去上清液，加入75% mL，振搖，2~8 ℃ 7500 g離心5 min；d) 棄去上清，干燥沉淀物（室溫約5 min）；加入20 181。L DEPC水溶解，20 ℃保存或立即使用（置冰上）。 引物設(shè)計根據(jù)文獻(xiàn)和PRRSV代表株VR2332和LV設(shè)計了一對引物：PRRSV N1： 5′ATGGCCAGCCAGTCAATCA3′PRRSV N2： 5′TCGCCCTAATTGAATAGGTG3′ RT總體積為10 181。L，反應(yīng)體系如下：5RT buffer 181。LdNTP（10 mmol/L） 181。LOligo(dT)18 181。LRNA 模板 7 181。L混勻離心，65 ℃作用10 min，冰上冷卻，加入MMLV （200 U/181。L） 181。L，42℃1h，冰上冷卻后作為PCR模板。 PCRPCR 反應(yīng)總體積為25 181。L，包括：2條PRRSV引物（10 pmol/181。L） 各1 181。LMg++(25 mmol/L) 181。LdNTP ( mmol/L) 181。L10Buffer 181。LTaq 酶（5 U/181。L） 181。L模板cDNA 5 181。L滅菌雙蒸水 181。L瞬時離心混勻，將PCR反應(yīng)管置于PCR儀內(nèi)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性 5 min；94℃ 45 min；51℃ 45 min； 共35個循環(huán)，72℃ 1 min；72℃延伸 10 min。將PCR產(chǎn)物放4 ℃保存或立即做瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物。 結(jié)果分析與判定 ％瓊脂糖凝膠板的制備 g瓊脂糖，加入100 mL 1TAE中，加熱融化后，倒入放置在水平臺面上的凝膠盤中，膠板厚5 mm左右。依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣空），放入電泳槽中，加1TAE緩沖液淹沒膠面。 加樣取6～8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2～3 μL加樣緩沖液和和適量CYBgreen混勻后加入一個加樣孔。每次電泳至少加1孔陽性對照的擴(kuò)增產(chǎn)物作為對照，沒有陽性對照的情況下，一定加Marker。 電泳電壓80～100 V，或電流40～50 mA，電泳30～40 min。 結(jié)果觀察與判定電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察。如某一待檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA帶與陽性對照的帶在一條直線上，即他們與加樣孔的距離相同，或根據(jù)Marker判定大小與設(shè)計的大?。?00 bp或430 kb）一致，則該樣品判定為陽性。5 診斷判定PCR檢測結(jié)果陽性，表明該豬（群）已感染PRRSV，根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化判定豬群是否發(fā)病。九、古典豬瘟（CSFV）PCR檢測技術(shù)1 引用標(biāo)準(zhǔn)自定標(biāo)準(zhǔn)。2 范圍適用于古典豬瘟（CSFV）的PCR診斷。3材料 儀器：組織勻漿機(jī)；低溫臺式高速（13000～20000 r/min）離心機(jī)；DNA擴(kuò)增儀；水浴鍋；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；電泳凝膠成相分析系統(tǒng)；可調(diào)移液器一套，包括1～20 μL 2支，20～200μL 1支，200～1000μL 1支；與移液器匹配的滴頭； mL離心管； mL（與擴(kuò)增儀配套）塑料管。 試劑 Trizol試劑 氯仿 異丙醇 反轉(zhuǎn)錄酶MMLV（200 U/181。L） 75%乙醇 %焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液 mmol/L dNTP 10PCR Buffer 25 mmol/L MgCl2 10 μmol/L引物 50TAE（保存液）和1TAE（使用液） Loading Buffer 瓊脂糖 BSA( mg/mL) CYBgreen