20xx核酸檢測基本知識(編輯修改稿)
2024-10-17 10:47 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 3℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備。②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。③引物的延伸：DNA模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成1條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性—退火—延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成1個循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。檢測HIVRNA,需要先利用逆轉(zhuǎn)錄反應將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而以cDNA為模板進行PCR擴增即可，這樣的反應稱為RTPCR。實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。本技術(shù)的原理是使用熒光基團標記探針,5′端標記熒光基團R,3′端標記淬滅基團Q,在沒有PCR擴增時,由于熒光基團和淬滅基團空間距離很近,使熒光基團被淬滅,不發(fā)熒光。而當PCR擴增時,引物與熒光標記的特異性探針同時結(jié)合在模板上,熒光標記的探針與模板的結(jié)合位置位于上下游引物之間,利用Taq酶的5′3′外切酶活性,將熒光探針水解,熒光基團被釋放出來,由于在空間上與淬滅基團分開,則發(fā)出熒光。發(fā)出的熒光可以被熒光探頭檢測到,一邊擴增,一邊檢測,這樣就實現(xiàn)了“實時”
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