【文章內(nèi)容簡介】 。例如，對(duì)于低濃度金屬樣品，鹽度校正會(huì)導(dǎo)致假陰性的結(jié)果；而對(duì)于一些溶解度低的樣品，如苯酚，則會(huì)由于毒物的析出而導(dǎo)致假陽性結(jié)果；（ 3）單一發(fā)光細(xì)菌的使用難以做到適用于所有毒物。因此，其應(yīng)用范圍受到了很大限制。 此外，許多 微生物受到毒性物質(zhì)侵害后，會(huì)表現(xiàn)為活性下降、呼吸活性變?nèi)?，生理狀態(tài)發(fā)生變化等?；谶@個(gè)原理，研究者將硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)物用于有毒物質(zhì)的毒性檢測(cè)，通過測(cè)定硝化細(xì)菌的呼吸速率的變化來檢測(cè)廢水毒性，測(cè)得毒物的 EC50 值與發(fā)光菌法具有較好的相關(guān)性，該方法適用于測(cè)試城市污水和工業(yè)廢水的毒害作用，也適用于河道底泥的毒性檢測(cè)，應(yīng)用該方法已經(jīng)成功開發(fā)出毒性測(cè)試儀 [23,24,25]。 本 論文 的研究內(nèi)容和意義 我們 在前期的工作中提出了使用亞甲基藍(lán)和中性紅染料為指示劑的水體總毒性微生物光學(xué)檢測(cè)方法 [26]。當(dāng)有毒性物質(zhì)存在時(shí)，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)被破壞，從而允許更多的染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，通過光學(xué)檢測(cè)剩余染料的濃度即可實(shí)現(xiàn)對(duì)毒性的檢測(cè)。毒性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜造成傷害，一方面允許細(xì)胞外的物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，另一方面也會(huì)允許細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)流出。因此細(xì)胞內(nèi)的流出物可以作為細(xì)胞膜破損的標(biāo)志。鉀離子是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的無機(jī)離子，微生物通過位于原生質(zhì)膜上的離子通道蛋白 Na+， K+ATP 酶的作用將鉀離子運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)形成高濃度的鉀離子 [27]。當(dāng)細(xì)胞膜被毒性物質(zhì)破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鉀離子就會(huì)流出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞外的鉀離子濃度升高。通過檢測(cè)鉀離子濃度的變化，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)毒性的檢測(cè)。到目前為止，長春工程學(xué)院（畢業(yè)論文） 5 還沒有人報(bào)道過這種毒性測(cè)試方法。此外，某些蛋白質(zhì)，酶等胞內(nèi)物質(zhì)也可以在細(xì)胞膜破損后流出細(xì)胞，因而原則上這些物質(zhì)都可以作為毒性物質(zhì)的指示劑。但是，與鉀離子相比，它們所需要的細(xì)胞膜上的孔洞相對(duì)較大 [28]，因而不適合用于低濃度毒性物質(zhì)或者低毒性物質(zhì)的檢測(cè) [29]。 1998 年 Periasamy 等人系統(tǒng)的研究了卟啉分子與表面活性劑分子之間的相互作用，指出了表面活性劑分 子對(duì)卟啉熒光的增強(qiáng)機(jī)理 [30]。同時(shí)，我們也知道微生物的代謝過程會(huì)釋放出大量的類似表面活性劑的分子，因此可以預(yù)見微生物的代謝物溶液可以有效的增強(qiáng)卟啉的熒光。而熒光的增強(qiáng)程度與微生物的代謝物濃度，即微生物的活性有直接的聯(lián)系?；谶@個(gè)機(jī)理，我們就可以開發(fā)出一種新穎的微生物水體總毒性檢測(cè)方法。 2 實(shí)驗(yàn)部分 化學(xué)物質(zhì) 長春工程學(xué)院（畢業(yè)論文） 6 試劑 公司 備注 氯化鈉 北京化學(xué)試劑公司 用來配制培養(yǎng)基 蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司 用來配制培養(yǎng)基 YEAST EXTRACT OXOID 有限公司 用來配制培養(yǎng)基 大腸桿菌 中國普通微生物菌種保藏管理中心（ CGMCC） 4℃ 冰箱中保藏 KH2PO4 北京化學(xué)試劑公司 用來配制磷酸鹽緩沖溶液 Na2HPO4 北京化學(xué)試劑公司 用來配制磷酸鹽緩沖溶液 HCl 北京化學(xué)試劑公司 用來配制磷酸鹽緩沖溶液 NaOH 北京化學(xué)試劑公司 4℃ 冰箱中保藏 卟啉（ 1mmol/L） 北京化學(xué)試劑公司 4℃ 冰箱中保藏 DCP（ 10g/L） 阿拉丁試劑公司 4℃ 冰箱中保藏 磷酸鹽緩沖溶液（ PBS）是自制的。 制備方法： 將 12H2O 溶于 1000ml 的二次水中，添加 1MHCl 和 1MNaOH 把PBS 的 pH 值調(diào)至 . 儀器 長春工程學(xué)院（畢業(yè)論文） 7 儀器 型號(hào) 廠家 多振幅軌道搖床 ZHWY200B 上海智城分析儀器制造有限公司 超聲波清洗器 MW5065 昆山市超聲儀器有限公司 臺(tái)式冷凍離心機(jī) Centrifuge 5804 R EPPENDORF 熒光光譜儀 FLUOROMAX4 紫外可見分光光度計(jì) Cary 500 美國瓦里安公司 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 微生物培養(yǎng) 大腸桿菌（ DH 5α）的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度均是參照 CGMCC 和上海智城分析儀器制造有限公司說明書設(shè)定的。所用的微生物均在轉(zhuǎn)速為 190rpm 的搖床中培養(yǎng)。 15℃ 下離心 5 分鐘，轉(zhuǎn)速 5000rpm，用 1%NaCl 洗滌兩次。然后用 1%NaCl 將微生物制備成懸浮液保存于 常溫的環(huán)境中，所用的微生物都是當(dāng)天使用，不能過夜。 卟啉 的 熒光 增強(qiáng) 比較測(cè)定有毒化學(xué)物質(zhì) 把微生物用 磷酸緩沖溶液（ PBS） 稀釋到所需的 OD 值，再用紫外可見近紅外掃描分光光度計(jì)測(cè)量微生物 OD 值，其波長選在 600nm。 所用的有毒物質(zhì)（ 10ppmDCP）都是在實(shí)驗(yàn)初期事先配制好的，使用時(shí)用二次水將其稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的濃度值。在實(shí)驗(yàn)中，樣品包含 400ul微生物懸浮液， 100ul有毒化學(xué)物質(zhì)和 500ul PBS。同時(shí)，空白樣和實(shí)驗(yàn)樣品添加的其他物質(zhì)都用 PBS 來補(bǔ)充，所有的填補(bǔ)都是相同的。樣品在有鋁箔包裹下放入多振幅軌道搖床搖晃 60 分鐘，然后取出離心得到上層清液。這時(shí)的樣品中包含 500ul 上層清液 ， 400ul PBS和 100ul 卟啉，測(cè)定各個(gè)試樣的熒光光譜圖并進(jìn)行對(duì)比。而毒性檢測(cè)的原理是對(duì)比健康的微生物細(xì)胞和受到毒性物質(zhì)損害的細(xì)胞對(duì)卟啉熒光增強(qiáng)的峰值的差異。這樣的分析方法是測(cè)定上層清液中微生物代謝物的濃度與卟啉的熒光作用，使得實(shí)驗(yàn)操作起來比較簡便，同時(shí)也簡化了實(shí)驗(yàn)過程。 依據(jù)這個(gè)原理，毒性的大小是可長春工程學(xué)院（畢業(yè)論文） 8 以通過毒性物質(zhì)對(duì)微生物釋放的鉀離子的抑制率 來 進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算公式為 Inhibition Ratio（ %） =（ 1???????????） 100% A 是在有毒性物質(zhì)的環(huán)境中培養(yǎng)的微生物后，上層清液的微生物代謝物與卟啉在 621nm處的熒光峰值 與在 636nm 處的熒光峰值的比值 ； B 是 在沒有有毒性物質(zhì)的環(huán)境中培養(yǎng)的微生物后， 上層清液的微生物代謝物與卟啉 在 621nm 處的熒光峰值 與在 636nm 處的熒光峰值的比值 ； C 是 空白樣 （沒有搖床的微生物代謝物與卟啉） 在 621nm 處的熒光峰值 與在 636nm 處的熒光峰值的比值 。 注：每個(gè)樣品都做兩個(gè)平行樣，故計(jì)算時(shí)要取其平均值。 結(jié)果和討論 原理 圖 1 是本論文 基于微生物的代謝物對(duì)卟啉熒光的增強(qiáng)作用原理進(jìn)行檢測(cè) 。當(dāng)有毒性物質(zhì)存在的時(shí)候，微生物的細(xì)胞膜受到抑制，使其釋放出來的鉀離子減少，從而測(cè)得的熒光現(xiàn)象逐漸減弱。通過對(duì)比熒光現(xiàn)象的峰高，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)毒性物質(zhì)的檢測(cè)。由于 3， 5二氯苯酚（ DCP） 的毒性較小、價(jià)格便宜、容易用熒光儀檢測(cè)，所以本實(shí)驗(yàn)選用 DCP。 此外，實(shí)驗(yàn)最終現(xiàn)象是無毒性物質(zhì)的熒光增強(qiáng)作用要比有毒性物質(zhì)的高。 : PBS ： microanisms 圖 1 基于卟啉熒光增強(qiáng)的微生物水體總毒性測(cè)試原理 長春工程學(xué)院（畢業(yè)論文） 9 圖 1 的實(shí)驗(yàn)過程如下： （ 1） E． Coli/ul DCP/PBS/ul PBS/ul 總量 /ml 400 100 500 1 （ 2） 上層清液 /ul PBS/ul 卟啉 /ul 總量 /ml 500 400 100 1 注：在步驟（ 1）完成后要在搖床中培養(yǎng) 60 分鐘后取出離心得到上層清液。 在步驟（ 2）中，沒有加卟啉之前要靜置 60 分鐘，使得樣品中的各種反應(yīng)進(jìn)行完全，以便得到更加穩(wěn)定的作用。 DNA 的選用對(duì)毒性測(cè)試的影響 由于卟啉與 DNA 的相互作用會(huì)導(dǎo)致熒光光譜性質(zhì)發(fā)生變化，為了使得實(shí)驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果 熒光增強(qiáng) 比較顯著，則 實(shí)驗(yàn)初期要 考慮 是否 使用 DNA。 圖 2A 和圖 4B 是兩種不同的 DNA， 圖 2B 中的 DNA 是實(shí)驗(yàn)初期一直 使 用的。在 實(shí)驗(yàn)操作和其他條件都相信的情況 下，只改變 DNA 的種類 ， 但 出現(xiàn)的熒光 增強(qiáng) 現(xiàn)象是不同的。很明顯， 圖 2A 中的 熒光增強(qiáng) 現(xiàn)象比較混亂，沒有一定的規(guī)律；而 圖 2B 中的 熒光增強(qiáng) 現(xiàn)象 與實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果一致， 表明： DCP 會(huì)抑制微生物釋放鉀離子，從而熒光現(xiàn)象會(huì)降低。因此，依據(jù)圖 2B 的 熒光增強(qiáng) 現(xiàn)象，則選用 Add 280ulH2O DNA 可以穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 。 在實(shí)驗(yàn)過程設(shè)計(jì)完成后，我們需要改變實(shí)驗(yàn)過程中的單一變化條件 （改變微生物的濃度和反應(yīng)時(shí)間） ，以便 得到優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，如圖 2C、 D、 E、 F和 G。由圖 2C和 2D 我們可以看出，證實(shí)了選用 DNA 得到的熒光現(xiàn)象要比沒有選用 DNA 得