基因功能分析的基本策略(編輯修改稿)
2025-02-26 10:38 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 或者 Ftp／ FRT 重組系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這兩個(gè)系統(tǒng)都是 位點(diǎn)特異性重組酶 系統(tǒng) ，已發(fā)展成為在體內(nèi)、外進(jìn)行遺傳操作的有力工具。 ?這兩個(gè)系統(tǒng)的應(yīng)用，可以使靶基因的表達(dá)或缺失發(fā)生在試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官。 ?此外，若與控制 Cre或 Ftp表達(dá)的其他誘導(dǎo)系統(tǒng)相結(jié)合， 還可以對(duì)某一基因同時(shí)實(shí)現(xiàn)時(shí)空兩方面的調(diào)控。 ? Cre／ loxP系統(tǒng)來(lái)源于 F1噬菌體，可以介導(dǎo) 位點(diǎn)特異的 DNA重組 。 ?該系統(tǒng)含有兩種成分：①一段長(zhǎng) 34bp的 DNA序列，含有兩個(gè) 13 bp的反向重復(fù)序列和一個(gè) 8 bp的核心序列。這段34bp序列是重組酶識(shí)別的位點(diǎn)，被稱為 loxP位點(diǎn) (10cus of X— over in P1)。 ?② Cre重組酶 (cyclizationrebination)，它是一種由 343個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā) loxP位點(diǎn)的 DNA重組。任何序列的 DNA，當(dāng)其位于兩個(gè) loxP位點(diǎn)之間的時(shí)候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失 (兩個(gè) loxP位點(diǎn)的方向相同 )，要么方向發(fā)生倒轉(zhuǎn) (兩 loxP位點(diǎn)的方向相反 )，如圖所示。 Cre／ loxP系統(tǒng)的原理 第三節(jié) 利用基因沉默技術(shù)對(duì)基因功能進(jìn)行分析 結(jié)構(gòu)基因功能最終是通過(guò)其表達(dá)的蛋白質(zhì)來(lái)體現(xiàn)，因此結(jié)構(gòu)基因功能的研究可以在 RNA水平上進(jìn)行，通過(guò)干預(yù)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程或減少蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來(lái)分析基因的功能。目前在 RNA水平上分析基因功能的方法主要有兩類： 一類是反義 RNA技術(shù)封閉mRNA的功能；另一類是 RNA干涉技術(shù)使基因處于沉默狀態(tài)。 一、反義 RNA技術(shù) 反義 RNA技術(shù)是根據(jù) RNA序列 人工合成的互補(bǔ) RNA。根據(jù)反義 RNA的作用機(jī)制可將其分為三類： 反義 RNA是直接作用于靶 mRNA的核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)或與靶 mRNA直接 結(jié)合形成雙鏈 RNA，從而直接抑制mRNA的翻譯或被 RNA酶 Ⅲ 識(shí)別降解。 反義 RNA是 與 mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合 ，引起 mRNA構(gòu)象的變化，從而抑制其翻譯。 反義 RNA是 作用于基因的啟動(dòng)子 ，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。 二、 RNA干涉技術(shù) 最早是由 Andrew Fire 和 Craig Mellocai 兩人在 1998年 2月一次實(shí)驗(yàn)中，將雙鏈 RNA注射給線蟲，發(fā)現(xiàn)其可以引起一種高效、特異的基因抑制效應(yīng)，他們將這種由雙鏈 RNA引起的特異性基因抑制現(xiàn)象稱為 RNA干涉。 RNA干涉技術(shù) 是指由短的雙鏈 RNA誘導(dǎo)的同源 RNA降解的過(guò)程，可使基因的表達(dá)受到抑制。 它是在基因的轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)的一種研究基因功能的方法。 RNA干涉的機(jī)制： 1. Dicer是由 核酸內(nèi)切酶 和 解旋酶 等組成的 酶復(fù)合體 。 2. 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)異常雙鏈 RNA時(shí)，如病毒 RNA，可以激活 Dicer，被激活的 Dicer識(shí)別并將其切割成短的雙
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