fz第六章分子生物學(xué)基本研究法基因功能研究技術(shù)(編輯修改稿)
2025-01-18 23:49 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有 專一性強(qiáng)、染色體 DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。 基因敲除分為： ?完全基因敲除 ?條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除） 完全基因敲除：指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性； 條件型基因敲除：指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。 關(guān)于基因敲除技術(shù)，噬菌體的 Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的 FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以 Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。 完全基因敲除： Neo基因有雙重作用：①形成靶位點(diǎn)的插入突變；②作為正向篩選標(biāo)記。 取代型 插入型 由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低， 動(dòng)物的重組概率約為 102～ 105，植物的概率為 104～ 105，即使采用雙向選擇法也很難保證一次就從眾多細(xì)胞中篩選出真正發(fā)生 了同源重組的胚胎干細(xì)胞。 所以，得用多種 PCR及 Southern雜交等多種分子篩選技術(shù)驗(yàn)證所獲得的確實(shí)是目的基因被敲除的細(xì)胞系。 條件型基因敲除： 完全基因敲除往往導(dǎo)致胚胎死亡；而條件型基因敲除，由于具有可調(diào)節(jié)性而受到科學(xué)家的重視。 特點(diǎn)：常將正向選擇標(biāo)記 neor置于內(nèi)含子中。 6. 2. 2 高等動(dòng)物基因敲除技術(shù) 真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括： 構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組 DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中。 使外源 DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的 DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。 主要實(shí)驗(yàn)流程及篩選步驟： 模式動(dòng)物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應(yīng)用。 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES) 回交 顯微注射篩選后的 ES細(xì)胞 注入母體 重組載體中的 DNA整合到內(nèi)源基因組中得以表達(dá) 將正向選擇標(biāo)記neor置于載體中 與 ES細(xì)胞重組 篩選重組后的 ES細(xì)胞 顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對(duì)大些。 電穿孔法命中率比顯微注射低 ，操作使用方 便。 胚胎干細(xì)胞（ ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。 6. 2. 3 植物基因敲除技術(shù) TDNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。 利用根癌農(nóng)桿菌 TDNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有 報(bào)告基因 的 DNA序列整合到基因組 DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會(huì)影響該基因的表達(dá)，從而使該基因 “ 失活 ” 。 TDNA： 是農(nóng)桿菌 Ti或 Ri質(zhì)粒中的一段 DNA序列，可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中，已成為植物分子生物學(xué)中廣泛應(yīng)用的 遺傳轉(zhuǎn)化載體 ， 是 Ti質(zhì)粒上的片斷 。 Ti質(zhì)粒因?yàn)樽陨硪恍﹥?yōu)點(diǎn)很適合作為導(dǎo)入外源基因的載體。 報(bào)告基因： 是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，是一個(gè)表
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