劉中成重組體的篩選與鑒定(編輯修改稿)
2025-02-26 09:12 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 性結(jié)合。 酶連（ enzymelinke） ： 二抗上攜帶一種酶 能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測目標(biāo)分子的含量。 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 二抗 酶 待測基因 產(chǎn)物蛋白 一抗 二抗 無色的底物 有色的產(chǎn)物 比色觀察 酶 19 在特殊的分光光度儀（ 酶標(biāo)儀 ）上比色，打印出結(jié)果。 （ 5）比色 四、免疫印跡（ western blotting）法 ： 在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用 轉(zhuǎn)膜和免疫 的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。 （ 1） SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì) 維持線性狀態(tài) ，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì) 帶上負(fù)電荷 。 ① SDS: （ SDSPAGE）： ② 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）： （ Polyacrylamide gel electrophoresis） 在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動， 移動的速率主要取決于其分子量大小（鏈的長短） ，從而把不同分子量的肽鏈分開。 電泳 buffer 電泳 buffer 點(diǎn)樣 電泳方向 ③ 蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn) 已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。 Da 道爾頓 (質(zhì)量單位 , 等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。 一克約為 6 1023道爾頓 Dalton SDS PAGE ④ 凝膠中的蛋白質(zhì)染色： 考馬斯亮藍(lán)： 靈敏度底、只能檢出 ，但可褪色回收。 硝酸銀： 靈敏度高、可檢出 25ng/帶。 2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。 1）直接染色 直接染色電泳結(jié)果 （ 2） Western blotting 電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、 PVDF膜、中性尼龍膜等）。 ① Western（轉(zhuǎn)膜） 膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下 橫向 轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。 膜 膠 蛋白 Western裝置 ② Blotting 原理與 ELISA相同。 待測蛋白 硝酸纖 維素膜 一抗 二抗 辣根過氧 化物酶 底物 產(chǎn)物， 并發(fā)出光 PAGE膠 待測蛋白 底片曝光 辣根過氧化物酶： HRPO 1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合。 2）洗去未結(jié)合的一抗。 3）用二抗與一抗結(jié)合（ 二抗上帶有 HRPO）。 4）清洗掉未結(jié)合的二抗。 5）用 HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，沖洗膠片。 ③ Blotting過程 ④結(jié)果 多克隆抗體Blotting的結(jié)果 單抗 blotting結(jié)果 第七節(jié) 幾種常用的 真核生物重組基因選擇方法 真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。 二氫葉酸 四氫葉酸 二氫葉酸還原酶（ dihydrofolate reductase， DHFR） 一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記 1. 胸苷激酶（ thymidine kinase, tk） （ 1） TK選擇原理 ① 四氫葉酸的必要性 DHFR ②氨甲喋啉（ Methotrexate）的抑制作用 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。 能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷 dATP、 dCTP和 dTTP的合成： dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 ④ 胸苷酸激酶 的補(bǔ)救作用 TK+細(xì)胞 能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（ T）合成 TTP，存活。 T tk ③ 次黃嘌呤
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