乙型肝炎的病原學(xué)診斷(編輯修改稿)
2025-02-11 03:29 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 ?熒光閾值（ threshold)的缺省設(shè)置是 315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍，即： threshold=10 SD cycle015 34 Ct值與起始模板的關(guān)系 ? 每個(gè)模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多， Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的 Ct值，及可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 35 熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線 未知標(biāo)本 Crossing Point (Cycles) log (copy number) n log (F2/F1) n log (F2/F1) Target 38 36 除常規(guī)的一對(duì)引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個(gè)能與 PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。該探針的 539。端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)， 339。標(biāo)記另一個(gè)熒光基團(tuán)。此時(shí) 539。端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的 3’端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生 FRET），因此正常情況下檢測(cè)不到該探針 539。端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。 Taqman探針原理 37 但當(dāng)溶液中有模板時(shí) ， 模板變性后低溫退火時(shí) ，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合 。 在引物的介導(dǎo)下 ，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處 ，發(fā)生鏈的置換； Taqman探針原理 38 Taqman探針原理 Taq酶的 539?！?3’ 外切酶活性將探針 539。端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來(lái) ， 游離于反應(yīng)體系中 ，從而脫離 3’ 端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽 ， 接受光刺激發(fā)出熒光 ， 切割的熒光基團(tuán)數(shù)與 PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例 。 因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量 。 39 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo) ?Ct值的重現(xiàn)性 :同一模板 Ct值恒定 . ?Ct值與起始模板的線性關(guān)系決定 . ?內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR有影響 :加入內(nèi)標(biāo)后PCR反應(yīng)變成雙重 PCR,存在競(jìng)爭(zhēng)。無(wú)法加入合適的起始拷貝的內(nèi)標(biāo)。 40 定量 PCR在臨床診斷治療上的意義 ?對(duì)致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測(cè) ?彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷（如 HCV） ?縮短診斷的窗口期（如 HBV,HIV） ?對(duì)治療過(guò)程進(jìn)行藥物療效監(jiān)測(cè)指導(dǎo)用藥 ?加快疾病的診斷，病情判斷預(yù)后 ?對(duì)染色體突變導(dǎo)致的遺傳病進(jìn)行檢測(cè) 41 定量 PCR在乙肝檢測(cè)中意義 ?1. 判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性 ?2. PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評(píng)價(jià) ?3. 觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量 ?4. 獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷 ?5. 預(yù)測(cè)病情、判斷預(yù)后 ?6. 器官移植、母嬰垂直傳播 42 43 44 HB sA g HB e A g 抗 HB c 抗 HB c I gM 抗 HB e 抗 HB s 臨床意義+ + /+ +++ 急性早期+ + / ++ + + / 慢性+ + + + /+++ + 慢活肝+ + ~+ + + /+ + / 慢性攜帶+
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