乙型肝炎的病原學(xué)診斷(編輯修改稿)
2025-02-11 03:29 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 ?熒光閾值（ threshold)的缺省設(shè)置是 315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10倍，即： threshold=10 SD cycle015 34 Ct值與起始模板的關(guān)系 ? 每個(gè)模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板數(shù)越多， Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的 Ct值，及可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 35 熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線 未知標(biāo)本 Crossing Point (Cycles) log (copy number) n log (F2/F1) n log (F2/F1) Target 38 36 除常規(guī)的一對(duì)引物以外，PCR反應(yīng)體系中另加有一個(gè)能與 PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。該探針的 539。端標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)， 339。標(biāo)記另一個(gè)熒光基團(tuán)。此時(shí) 539。端熒光基團(tuán)吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的 3’端熒光淬滅基團(tuán)（發(fā)生 FRET），因此正常情況下檢測(cè)不到該探針 539。端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。 Taqman探針原理 37 但當(dāng)溶液中有模板時(shí) ， 模板變性后低溫退火時(shí) ，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合 。 在引物的介導(dǎo)下 ，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處 ，發(fā)生鏈的置換； Taqman探針原理 38 Taqman探針原理 Taq酶的 539?！?3’ 外切酶活性將探針 539。端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來 ， 游離于反應(yīng)體系中 ，從而脫離 3’ 端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽 ， 接受光刺激發(fā)出熒光 ， 切割的熒光基團(tuán)數(shù)與 PCR產(chǎn)物的數(shù)量成比例 。 因此根據(jù)PCR反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量 。 39 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR無需內(nèi)標(biāo) ?Ct值的重現(xiàn)性 :同一模板 Ct值恒定 . ?Ct值與起始模板的線性關(guān)系決定 . ?內(nèi)標(biāo)對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR有影響 :加入內(nèi)標(biāo)后PCR反應(yīng)變成雙重 PCR,存在競(jìng)爭(zhēng)。無法加入合適的起始拷貝的內(nèi)標(biāo)。 40 定量 PCR在臨床診斷治療上的意義 ?對(duì)致病微生物核酸含量進(jìn)行定量檢測(cè) ?彌補(bǔ)免疫檢測(cè)的缺陷（如 HCV） ?縮短診斷的窗口期（如 HBV,HIV） ?對(duì)治療過程進(jìn)行藥物療效監(jiān)測(cè)指導(dǎo)用藥 ?加快疾病的診斷，病情判斷預(yù)后 ?對(duì)染色體突變導(dǎo)致的遺傳病進(jìn)行檢測(cè) 41 定量 PCR在乙肝檢測(cè)中意義 ?1. 判斷疾病的嚴(yán)重程度和傳染性 ?2. PCR結(jié)果與血清免疫學(xué)結(jié)果的綜合評(píng)價(jià) ?3. 觀察抗病毒藥物療效，指導(dǎo)藥物用量 ?4. 獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查及早期診斷 ?5. 預(yù)測(cè)病情、判斷預(yù)后 ?6. 器官移植、母嬰垂直傳播 42 43 44 HB sA g HB e A g 抗 HB c 抗 HB c I gM 抗 HB e 抗 HB s 臨床意義+ + /+ +++ 急性早期+ + / ++ + + / 慢性+ + + + /+++ + 慢活肝+ + ~+ + + /+ + / 慢性攜帶+
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