【文章內(nèi)容簡介】 /2023 68 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) ? 半定量試驗(yàn)是使用凝膠法 估測 供試品中內(nèi)毒素含量的方法。 系通過確定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。 3/5/2023 69 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) ? 原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點(diǎn)濃度的稀釋倍數(shù) 與 鱟試劑靈敏度 的 乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量 。 ? 操作：用檢查用水將供試品溶液從 已確定的不干擾濃度或稀釋倍數(shù) 下開始進(jìn)行對倍稀釋，制備成 8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過所使用鱟試劑的 MVD。 3/5/2023 70 編號 內(nèi)毒素濃度 / 配制內(nèi)毒素的溶液 稀釋用液 稀釋倍數(shù) 所含內(nèi)毒素的濃度 平行管數(shù) A 無 /供試品溶液 檢查用水 1 2 4 8 — 2 2 2 2 B 2λ/供試品溶液 1 2λ C 2 λ/檢查用水 檢查用水 1 2 4 8 2λ 1λ 2 2 2 2 D 無 /檢查用水 — — — 2 A：沒有超過 MVD并且通過干擾試驗(yàn)的供試品系列稀釋液 。 B：供試品陽性對照 。 （ 為確證不存在干擾作用 ） C：標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列 。 （ 為確證本次試驗(yàn)的操作和環(huán)境都符合要求 。 ） D：陰性對照 。 3/5/2023 71 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 結(jié)果判斷： ? 當(dāng)陰性對照溶液 D的平行管均為陰性 ? 供試品陽性對照溶液 B的平行管均為陽性 ? 系列溶液 C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值在～ 2λ之間 試驗(yàn)有效 3/5/2023 72 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 結(jié)果計(jì)算： 內(nèi)毒素濃度 λ 終點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 系列溶液 C 稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 供試品系列溶液 A PPC溶液 B NC溶液 D 3/5/2023 73 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 結(jié)果計(jì)算： 內(nèi)毒素濃度 λ 終點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 系列溶液 C λ 稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 供試品系列溶液 A PPC溶液 B NC溶液 D λc=lg1（ ∑X/2） = ，在 ～ 2λ之間 仍以標(biāo)示靈敏度 λ為該批鱟試劑的靈敏度 。 3/5/2023 74 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 結(jié)果計(jì)算： 內(nèi)毒素濃度 λ 終點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 系列溶液 C λ 稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 供試品系列溶液 A 4? λ 2? λ PPC溶液 B NC溶液 D CE=lg1（ ∑X/2） = lg1（（ lg4 λ +lg2 λ） /2） = λ 3/5/2023 75 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 結(jié)果計(jì)算： ? 如果檢驗(yàn)時采用的是供試品的稀釋液 ， 則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù) 。 3/5/2023 76 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 結(jié)果計(jì)算： ? 例：右旋糖酐 20葡萄糖注射液 ，限值為 。 通過使用 3個鱟試劑廠家的鱟試劑對 3個不同廠家的 7批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)證實(shí)：右旋糖酐 20葡萄糖注射液稀釋 2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查。 使用靈敏度為 酐 20葡萄糖注射液進(jìn)行凝膠半定量試驗(yàn)。 3/5/2023 77 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 例： ? 計(jì)算 MVD MVD=? 從已確定不干擾的稀釋倍數(shù) 2倍起，再進(jìn)行 8倍的稀釋。（相當(dāng)于又將供試品原液進(jìn)行了 16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒有超過 MVD。） 3/5/2023 78 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 例： 內(nèi)毒素濃度 終點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 系列溶液 C 稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 右旋糖酐 20葡萄糖注射液系列溶液 A 4? 2? PPC溶液 B NC溶液 D CE=lg1（ ∑X/2） = lg1（（ lg4 ? +lg2 ? ） /2） = ? = EU/ml 3/5/2023 79 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 例： ? 由于檢驗(yàn)時采用的是右旋糖酐 20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數(shù) —— 2倍稀釋液 ， 因此計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù) 2。 ? 原右旋糖酐 20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為： 2 ? = EU/ml 3/5/2023 80 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 結(jié)果計(jì)算： ? 如試驗(yàn)中供試品溶液的結(jié)果都為陰性 ， 應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于 λ（ 如果檢驗(yàn)的是稀釋過的供試品 ， 則記錄為小于 λ乘以該供試品的最低稀釋倍數(shù) ） 。 3/5/2023 81 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 例： 內(nèi)毒素濃度 終點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 系列溶液 C 稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 右旋糖酐 20葡萄糖注射液系列溶液 A 1? 1? PPC溶液 B NC溶液 D CE lg1（ ∑X/2） = λ = EU/ml 2 ? = 原右旋糖酐 20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：小于 3/5/2023 82 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 結(jié)果計(jì)算： ? 如果結(jié)果都為陽性 ， 應(yīng)記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以 λ。 3/5/2023 83 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) 內(nèi)毒素濃度 終點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 系列溶液 C 稀釋倍數(shù) 1 2 4 8 右旋糖酐 20葡萄糖注射液系列溶液 A 8? 8? PPC溶液 B NC溶液 D CE lg1（ ∑X/2） = 8λ = EU/ml 2 ? = 原右旋糖酐 20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：大于 3/5/2023 84 例： CE lg1（ ∑X/2） = 8λ = EU/ml 2 ? = 原右旋糖酐 20葡萄糖注射液中內(nèi)毒素含量為：大于 3/5/2023 85 凝膠法 凝膠半定量試驗(yàn) ? 若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限值 ， 判供試品符合規(guī)定 。 ? 若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限值 ， 判供試品不符合規(guī)定 。 3/5/2023 86 細(xì)菌內(nèi)毒檢查方法學(xué)研究的內(nèi)容 ? 一、前言 ? 二、細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定 ? 三、確定細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的有效濃度范圍 ? 四、鱟試劑靈敏度的復(fù)核 ? 五、凝膠法干擾試驗(yàn) 方法學(xué) ? 六、制定藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ? 七、中國藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的情況 3/5/2023 87 一、前言： 新品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的設(shè)計(jì)原理 ? 如果藥品中存在阻礙或促進(jìn)該反應(yīng)的因素時，均會導(dǎo)致結(jié)果的異常。當(dāng)檢測一個新品種中內(nèi)毒素時，須證明該樣品本身是否存在這些因素，這就是通常說的干擾試驗(yàn)。 ? 當(dāng)其存在某種干擾因素時，為了排除干擾，最簡單的方法就是對其進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?。通過稀釋，可以降低該樣品中干擾成份的濃度，需在此基礎(chǔ)上對樣品進(jìn)行其他方法的處理。 3/5/2023 88 二、細(xì)菌內(nèi)毒素限值（ L)的確定 ? 藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是一種限度試驗(yàn)，首先必須確定供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。當(dāng)供試品含內(nèi)毒素低于這個限值時，按規(guī)定給藥途徑用藥，就不會引起熱原反應(yīng)；相反就有可能引起熱原反應(yīng)。 ? 按人用劑量計(jì)算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實(shí)際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。 3/5/2023 89 二、細(xì)菌內(nèi)毒素限值（ L)的確定 ? 藥品、生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素限值按下式確定： L=K/M ? 式中， L為供試品內(nèi)毒素限值，以 EU/ml、 EU/mg、 EU/U表示。 ? K為人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以 EU/（ ）表示，注射劑 K=5EU/（ ）；鞘內(nèi)用注射劑 K=（ ） 。 放射性藥品注射劑 K=（ ）。 ? M為人用每公斤體重每小時的 最大供試品劑量 ，以 ml/（ ）、 mg/（ ）或 U/（ ）表示 ,人均體重按60kg計(jì)算，注射時間若不足１小時，按１小時計(jì)算。 3/5/2023 90 二、細(xì)菌內(nèi)毒素限值（ L)的確定 計(jì)算舉例：注射用阿莫西林鈉 根據(jù)國家藥典會《臨床用藥須知》所載本品臨床用 法用量為：“肌肉注射或稀釋后靜脈滴注，一 次 ~1g，一日 3~4次；小兒按體重每日 50~100mg/kg，分 3~4次靜脈滴注?！? M成人＝ 1000mg247。 60kg=() M兒童＝ 100mg/() 247。 3=() L=K/M=5EU/() 247。 mg/()= 3/5/2023 91 二、細(xì)菌內(nèi)毒素限值（ L)的確定 限值計(jì)算時做必要調(diào)整的幾種情況 從嚴(yán)原則（已有國家標(biāo)準(zhǔn)、國外藥典收載的品種，執(zhí)行嚴(yán)的） 聯(lián)合用藥 特殊情況 3/5/2023 92 三、確定內(nèi)毒素檢查的有效濃度范圍 ? 為了確定供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的有效濃度范圍，首先要計(jì)算供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時的稀釋倍數(shù)（ MVD)。其最大有效稀釋倍數(shù) (MVD)按下式計(jì)算： ? MVD=CL/λ ? 式中， L為供試品的內(nèi)毒素限值 。 C為供試品溶液的濃度，當(dāng) L以 EU/ml表示時，則 C等于 。 當(dāng) L以 EU/mg或 EU/U活性單位表示時，則 C的單位為 mg/ml或 U活性單位／ ml ? λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度 (EU/ml)。 3/5/2023 93 三、確定內(nèi)毒素檢查的有效濃度 ? 最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限值的檢測。 ? MVD=cL/λ L:供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值 C:供試品溶液的濃度 λ：在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（ EU/ml),或是光度測定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低的內(nèi)毒素濃度（如標(biāo)準(zhǔn)曲線為 50、 。 3/5/2023 94 三、確定內(nèi)毒素檢查的有效濃度 ? 計(jì)算舉例： ? a: 當(dāng) L以 EU/ml表示時，則 c= 適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng) 小于 xxEU/ml。 例如：葡萄糖注射液，規(guī)定限值為應(yīng)小于 EU /ml，當(dāng)使用靈敏度為 檢驗(yàn)時，則 MVD=247。 3/5/2023 95 三、確定內(nèi)毒素檢查的有效濃度 ? 計(jì)算舉例： b、當(dāng) L以 EU/mg或 EU/U表示時，濃度 C的單位需為 mg/ml或 U/ml。 適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于 xxEU/mg或EU/U 注：注射液一般以 EU/ml表示 原料及注射用粉針一般用 EU/mg表示 3/5/2023 96 三、確定內(nèi)毒素檢查的有效濃度 例如：注射用阿莫西林鈉 計(jì)算限值為 ，使用靈敏度為。 如稱取 100mg注射用阿莫西林鈉，用 5ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為 20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。 MVD=20mg/247。 倍（ 20mg/24倍 =) 3/5/2023 97 三、確定內(nèi)毒素檢查的有效濃度 ? 如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取 1，計(jì)算供試品的最小有效稀釋濃度 C=λ/L. ? 適用于供試品為固體的情況，計(jì)算得到的最小有效稀釋濃度即 MVD下的該供試品的濃度。如：注射用阿莫西林鈉L=,使用鱟試劑 λ=,則C=247。 3/5/2