基因功能分析的基本策略(ppt76頁)(編輯修改稿)
2025-02-07 14:48 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 dsRNADicer cleavage of dsRNAsiRNARNAi 抑制基因表達(dá)的機(jī)理siRNA associatedWith RISC plexCell Membrane5’P OH3’ Target mRNARNAi機(jī)制 DicerRISC堿基互補(bǔ)酶解RNA干擾實(shí)驗(yàn)的基本過程1. 確定干擾靶點(diǎn)干涉靶點(diǎn)序列應(yīng)具備的條件：① 盡量避開蛋白結(jié)合位點(diǎn)；② 一般應(yīng)具有 AA（ N19） TT或 AA（ N21）序列特征； ③ G＋ C比比例為 50%左右；④ 被干涉的靶序列應(yīng)該是特異性的，和其它 RNA沒有同源性；⑤ 通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的 siRNA，以找到最有效的 siRNA序列提供 RNAi在線技術(shù)支持的公司（網(wǎng)站） 庫等進(jìn)行 BLAST比較 siRNAsiRNA制備常用的五種方法 ：化學(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)片斷 dsRNAs經(jīng) RNaseIII類降解 siRNA表達(dá)載體在細(xì)胞中表達(dá)形成 shRNAsPCR制備的 siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá) 化學(xué)合成質(zhì)量高，高純度，高成本適用于已經(jīng)驗(yàn)證過抑制效率的靶點(diǎn)序列不適于篩選靶點(diǎn)序列體外轉(zhuǎn)錄成本適中，省時(shí)，適用于篩選靶點(diǎn)序列不適用于長(zhǎng)期的研究或者針對(duì)某個(gè)特定靶點(diǎn)序列的大量研究長(zhǎng)片斷 dsRNA酶解法dsRNA在體外被 RnaseⅢ 家族成員切割成 siRNA不需要驗(yàn)證篩選多個(gè)靶點(diǎn)序列不適用于長(zhǎng)期研究或者特定siRNA序列的研究siRNA表達(dá)質(zhì)粒或者病毒載體在細(xì)胞中表達(dá) siRNAs AAACCAGCAGAACGTGTACGA 載體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá) siRNA方法的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性好siRNA表達(dá)載體一旦構(gòu)建成功，可以無限制的應(yīng)用于研究適用于長(zhǎng)期的對(duì)于某個(gè)基因的研究，尤其是帶有篩選標(biāo)記的載體，能夠用于構(gòu)建特定基因缺陷的細(xì)胞株 RNA的干擾轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞對(duì)目標(biāo) RNA干涉程度進(jìn)行分析：可采用 RTPCR在 RNA水平上監(jiān)測(cè)、 Westernblot在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行監(jiān)測(cè)RNAi實(shí)例 (載體法 )： Target gene： cmyc n 查找靶基因 mRNAn 利用網(wǎng)絡(luò)在線支持，尋找 siRNA序列n 根據(jù)查找的 siRNA序列，合成長(zhǎng)鏈 oligon 構(gòu)建載體n 轉(zhuǎn)染n 檢測(cè)效應(yīng)（包括干擾效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)）檢索文獻(xiàn)獲取有實(shí)驗(yàn)證明有效的靶點(diǎn)序列（核對(duì)）目的基因 mRNA獲取 ：載體構(gòu)建： dsDNA形成：退火 載體的酶切和回收 連接 轉(zhuǎn)化 鑒定轉(zhuǎn)染 ： 瓶頸之一 含有真核細(xì)胞篩選標(biāo)志 含有熒光標(biāo)志效應(yīng)檢測(cè) ： mRNA水平和蛋白水平兼顧(a) (b)24h48h干擾組陰性對(duì)照組0mRNA相對(duì)表達(dá)量cactinPokemon500300500300(d)Pokemonβacti
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