基因功能分析的基本策略(ppt76頁)(編輯修改稿)
2025-02-07 14:48 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 dsRNADicer cleavage of dsRNAsiRNARNAi 抑制基因表達的機理siRNA associatedWith RISC plexCell Membrane5’P OH3’ Target mRNARNAi機制 DicerRISC堿基互補酶解RNA干擾實驗的基本過程1. 確定干擾靶點干涉靶點序列應具備的條件：① 盡量避開蛋白結(jié)合位點；② 一般應具有 AA（ N19） TT或 AA（ N21）序列特征； ③ G＋ C比比例為 50%左右；④ 被干涉的靶序列應該是特異性的，和其它 RNA沒有同源性；⑤ 通常一個基因需要設計多個靶序列的 siRNA，以找到最有效的 siRNA序列提供 RNAi在線技術(shù)支持的公司（網(wǎng)站） 庫等進行 BLAST比較 siRNAsiRNA制備常用的五種方法 ：化學合成體外轉(zhuǎn)錄長片斷 dsRNAs經(jīng) RNaseIII類降解 siRNA表達載體在細胞中表達形成 shRNAsPCR制備的 siRNA表達框在細胞中表達 化學合成質(zhì)量高，高純度，高成本適用于已經(jīng)驗證過抑制效率的靶點序列不適于篩選靶點序列體外轉(zhuǎn)錄成本適中，省時，適用于篩選靶點序列不適用于長期的研究或者針對某個特定靶點序列的大量研究長片斷 dsRNA酶解法dsRNA在體外被 RnaseⅢ 家族成員切割成 siRNA不需要驗證篩選多個靶點序列不適用于長期研究或者特定siRNA序列的研究siRNA表達質(zhì)?；蛘卟《据d體在細胞中表達 siRNAs AAACCAGCAGAACGTGTACGA 載體介導的細胞內(nèi)表達 siRNA方法的特點操作簡便，穩(wěn)定性好siRNA表達載體一旦構(gòu)建成功，可以無限制的應用于研究適用于長期的對于某個基因的研究，尤其是帶有篩選標記的載體，能夠用于構(gòu)建特定基因缺陷的細胞株 RNA的干擾轉(zhuǎn)染靶細胞對目標 RNA干涉程度進行分析：可采用 RTPCR在 RNA水平上監(jiān)測、 Westernblot在蛋白質(zhì)水平上進行監(jiān)測RNAi實例 (載體法 )： Target gene： cmyc n 查找靶基因 mRNAn 利用網(wǎng)絡在線支持，尋找 siRNA序列n 根據(jù)查找的 siRNA序列，合成長鏈 oligon 構(gòu)建載體n 轉(zhuǎn)染n 檢測效應（包括干擾效應和生物學效應）檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）目的基因 mRNA獲取 ：載體構(gòu)建： dsDNA形成：退火 載體的酶切和回收 連接 轉(zhuǎn)化 鑒定轉(zhuǎn)染 ： 瓶頸之一 含有真核細胞篩選標志 含有熒光標志效應檢測 ： mRNA水平和蛋白水平兼顧(a) (b)24h48h干擾組陰性對照組0mRNA相對表達量cactinPokemon500300500300(d)Pokemonβacti
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