現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展與人類的生存(編輯修改稿)
2025-01-26 01:18 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 000轉(zhuǎn)時(shí)，則需 16h。離心完畢后，離心管中各種成分的分布可以在紫外光照射下顯示得一清二楚（圖 15一 2),蛋白質(zhì)漂浮在最上面， RNA沉淀在底部，超螺旋 DNA沉降較快，開環(huán)及線型 DNA沉降較慢。 經(jīng)染料 氯化銫密度梯度超離心后，質(zhì)粒 DNA及各種雜質(zhì)的分布 超螺旋DNA 閉環(huán)質(zhì)粒DNA 開環(huán)質(zhì)及線型 DNA 蛋白質(zhì) 石蠟油 ? 用注射針頭從離心管側(cè)面在閉環(huán)質(zhì)粒 DNA區(qū)帶部位刺人，收集這一區(qū)帶的 DNA,用異戊醇抽提收集到的 DNA以除去染料，然后透析除去 CsCI，再用苯酚抽提 12次，即可用乙醇將 DNA沉淀出來(lái)。這樣得到的 DNA有很高的純度，可供 DNA重組，測(cè)定序列及限制酶圖譜等之用。在少數(shù)情況下，需要特別純的 DNA時(shí)，可以將此 DNA樣品再進(jìn)行一次氯化銫密度梯度超離心分離。 三、核酸的凝膠電泳 ? ◇ （一）脂糖電泳 ? ◇ （二）聚丙烯酰胺凝膠電泳 （一）脂糖電泳 ? ◇ ? ◇ ? ◇ 分子片斷的測(cè)定 ? ◇ ? （ 1）核酸分子大小遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)成反比； ? （ 2）膠濃度遷移率與膠濃度成反比，常用 1%膠分離 DNA。 ? （ 3） DNA的構(gòu)象一般條件下超螺旋 DNA的遷移率最快，線型 DNA其次，開環(huán) DNA最慢。但在膠中加人過(guò)多的澳化乙錠時(shí)，上述分布次序會(huì)發(fā)生改變； ? ? （ 4）電壓一般采用 5V/cm,在適當(dāng)?shù)碾妷翰罘秶鷥?nèi)，遷移率與電壓大小成正比； ? （ 5）堿基組成有一定影響，但影響不大； ? （ 6）溫度 430℃ 都可以，常在室溫進(jìn)行，電流量過(guò)大時(shí)凝膠溫度升高，溶液蒸發(fā)，會(huì)造成電泳異常。 ? 電泳完畢后，將膠在熒光染料溴化乙錠的水溶液中染色 ( ug/mL）。溴化乙錠為一扁平分子，很易插人DNA中的堿基對(duì)之間。 DNA與溴化乙錠結(jié)合后，經(jīng)紫外光照射，可發(fā)射出紅一橙色可見熒光。 1ngDNA即可用此法檢出，所以此方法十分靈敏。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以大體判斷 DNA樣品的濃度。若在同一膠上加一已知濃度的 DNA作參考，則所測(cè)得的樣品濃度更為準(zhǔn)確?？梢杂渺`敏度很高的負(fù)片將凝膠上所呈現(xiàn)的電泳圖譜在紫外光照射下拍攝下來(lái)，作進(jìn)一步分析與長(zhǎng)期保留之用。 分子片斷的測(cè)定 ? 應(yīng)用凝膠電泳可以正確地測(cè)定 DNA片段的分子大小。實(shí)用的方法是在同一膠上加一已知其相對(duì)分子質(zhì)量的樣品（如圖 153中的 A DNA/Hind皿的片段）。電泳完畢后，經(jīng)澳化乙錠染色，照相，從照片上比較待測(cè)樣品中的 DNA片段與標(biāo)準(zhǔn)樣品中的哪一條帶最接近，即可推算出未知樣品中各片段的大小。目前許多試劑公司都能提供各種不同相對(duì)分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品。 ? 膠上某一區(qū)帶在紫外光照射下，切割下來(lái)，將切下的膠條放在透析袋中，裝上電泳液，在水平電泳槽中進(jìn)行電泳，讓膠上的 DNA釋放出來(lái)并進(jìn)一步粘在透析袋內(nèi)壁上，電泳 34 h后，將電極倒轉(zhuǎn)，再通電 3060 s，粘在壁上的 DNA重又釋放到緩沖液中。取出透析袋內(nèi)的緩沖液（丟棄膠條），用苯酚抽提 1一 2次，水相用乙醇沉淀。這樣回收的 DNA純度很高，可供進(jìn)一步進(jìn)行限制酶分析、序列分析或作末端標(biāo)記。回收率在 50%以上。 （二）聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 以聚丙烯酰胺作支持物。單體丙烯酰胺在加人交聯(lián)劑后，就成聚丙烯酰胺。由于這種凝膠的孔徑比瓊脂糖膠要小，所以可用予分析相對(duì)分子質(zhì)量小于 1 000 bp的 DNA片段和 RNA的電泳。聚丙烯酰胺中一般不含有 RNase，用于 RNA的分析不會(huì)分解樣品。但仍要留心緩沖液及其他器皿中所帶的 RNase。聚丙烯酰胺凝胺強(qiáng)度較好，常用垂直板電泳。 ? 聚丙烯酰胺凝膠上的 RNA樣品，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外光照射下，也能發(fā)出熒
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