【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 腈、甲醇、異丙醇等有機(jī)溶劑。 由于固定相骨架疏水性強(qiáng)，吸附的蛋白質(zhì)需用有機(jī)溶劑才能洗脫下來。 疏水色譜的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。 固定相介質(zhì)表面的疏水性比反相色譜介質(zhì)表面的疏水性弱。為有機(jī)聚合物鍵合相或大孔硅膠鍵合相。 流動(dòng)相為 pH6～ 8鹽水溶液。 在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)分子中疏水性部分與介子的疏水基團(tuán)產(chǎn)生疏水性作用而被吸附；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水性作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來，蛋白質(zhì)疏水性越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)。 與反相色譜相比，疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)變性可能性小。 ⑶親和層析（ affinity chromatography， AC） 親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用 。 配基：在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì)。 載體：與配基結(jié)合的支撐物。 親和層析大體可分三步： ①配基固定化 ②吸附目的物 ③樣品解吸 ⑷凝膠過濾 凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開。 根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量和蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。 主要應(yīng)用兩個(gè)方面： ①脫鹽和更換緩沖液 ②蛋白質(zhì)分子的分級(jí)分離。 在產(chǎn)品的形成階段前用于除去產(chǎn)物的多聚體及降解產(chǎn)物。 ⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除 DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在 ，蛋白質(zhì)的 pI在 上 ,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽(yáng)離子交換劑上，而 DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。 ⑵熱原質(zhì)的去除 熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。 ⑶病毒的去除 層析或過濾可將病毒去除。 ⒊非蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除 DNA、熱原質(zhì)和病毒的純化方法： ⑴ DNA的去除 DNA在 子，蛋白質(zhì)的 pI在 ,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質(zhì)為強(qiáng)酸性，可選擇條件使其吸附在陽(yáng)離子交換劑上，而 DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。 ⑵熱原質(zhì)的去除 熱原質(zhì)是腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質(zhì)中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。 ⑶病毒的去除 層析或過濾可將病毒去除。 四、選擇分離純化方法的依據(jù) ⒈根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇 分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮可用沉淀和超濾法。 產(chǎn)物在周質(zhì)表達(dá)是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)的一種形式 ,它可以避開可溶性表達(dá)蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質(zhì) ,在一定程度上有利于 分離純化 .為了獲得周質(zhì)蛋白 經(jīng)低濃度溶菌酶處理后 ,可采用滲透壓休克的方法來獲得。 可溶性表達(dá)產(chǎn)物破菌后的細(xì)胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。 ⒉根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單元組成一套分離工藝，盡早采用高效的分離手段。 先將最多的雜質(zhì)去除，將費(fèi)用最高、最費(fèi)時(shí)的分離單元放在最后階段，即通常先運(yùn)用非特異、低分辨的操作單元（如沉淀超濾和吸附等），以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要雜質(zhì)（包括非蛋白類雜質(zhì)）。 隨后采用高分辨率的操作單元（離子交換層析和親和層析）凝膠過濾放在最后，這樣可以提高分離效果。 層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨效率，并有利于各步驟間的過渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過濾。 ⒊根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇 分離純化工藝應(yīng)遵循以下原則： ⑴具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性 ⑵盡可能減少組成工藝的步驟 ⑶各技術(shù)步驟間要相互適應(yīng)和協(xié)調(diào) ⑷工藝過程中盡可能少用試劑 ⑸工藝所用時(shí)間要短 ⑹工藝和技術(shù)必須高效收率高易操作能耗低 ⑺具有較高的安全性 第十一節(jié) 變性蛋白的復(fù)性 ?外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成，雖然包涵體具有富集目標(biāo)蛋白質(zhì)、抗蛋白酶、對(duì)宿主毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但包涵體蛋白質(zhì)的復(fù)性率一般都很低 。 一 .包涵體的特性與形成 ? 、組成與特性： 包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性的固體顆粒。 一般含有 50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、 RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白 ompC、 ompF和 ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒 DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為 ，具有很高的密度（約 ），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。 NMR等新技術(shù)的應(yīng)用表明包涵體具有一定量的二級(jí)結(jié)構(gòu)，他們可能在復(fù)性的啟動(dòng)階段中具有一定的作用。 ?2包涵體的形成： 主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。 ? 、基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)率過高，超過了細(xì)菌正常的代謝水平，由于細(xì)菌的 δ因子的蛋白水解能力達(dá)到飽和，使之表達(dá)產(chǎn)物積累起來。研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。 ?、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。 ?、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi) pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。 ?、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等，致使中間體 大量積累，容易形成包涵體沉淀。 ?、蛋白質(zhì)在合成之后，于中性 pH或接近中性 pH的環(huán)境下，其本身固有的溶解度對(duì)于包涵體的形成比較關(guān)鍵，即是說，有的表達(dá)產(chǎn)率很高，如 Aspartase和 Cyanase,表達(dá)產(chǎn)率達(dá)菌體蛋白的 30%,也不形成包涵體，而以可溶形式出現(xiàn)。 ?、在細(xì)菌分泌的某個(gè)階段，蛋白質(zhì)分子間的離子鍵、疏水鍵或共價(jià)鍵等化學(xué)作用導(dǎo)致了包涵體的形成。 二 .包涵體的分離和溶解 ? 1基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后，可用：機(jī)械破碎、超聲破碎：?jiǎn)渭兂暺扑?，在小?guī)模下且菌量較少的情況下效果較好，由于能量傳遞和局部產(chǎn)熱等原因，很難用于大體積細(xì)胞懸液的破碎，這樣部分未破碎細(xì)胞與包涵體混在一起，給后期純化帶來困難。因此，在較大規(guī)模純化時(shí)先用溶菌酶破碎細(xì)菌的細(xì)胞膜，再結(jié)合超聲破碎方法，可顯著提高包涵體的純度和回收率。以及化學(xué)方法破碎使細(xì)菌裂解 ,然后以 500020230g 15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。 ?2洗滌：為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑 ,過高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解，如 2M尿素在 50mM Tris ,1mM EDTA中洗滌。此外可以用溫和去垢劑 TritonX100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。 ?3溶解：一般用強(qiáng)的變性劑如尿素（ 68M）、鹽酸胍（ GdnHCl 6M），通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，一般來講，鹽酸胍優(yōu)于尿素，因?yàn)辂}酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性 pH值下長(zhǎng)期保溫時(shí)?；蛴萌ス竸?SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，也可溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。 Kandula Suntha等人用 TritonX100來溶解 Zymononas mobilis levansucrase包涵體蛋白。 ? 另外，對(duì)于含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的