【文章內(nèi)容簡介】 五章 微生物的營養(yǎng)和生長 一 .微生物生長量的測定方法 是一種活菌計數(shù)法。其原理是活菌在液體培養(yǎng)基中生長繁殖使液體混濁，在固體培養(yǎng)基表面形成菌落，然后計數(shù)活菌的方法。 ①平板菌落計數(shù)法。 是一種常用的食品中細菌總數(shù)的計數(shù)法，有標準方法將待測樣品稀釋，然后取適宜的稀釋度樣品與固體培養(yǎng)基混勻，凝固后培養(yǎng)，然后計數(shù)平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以樣品的稀釋度， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 一 .微生物生長量的測定方法 即可計算出樣品的含菌數(shù)。也可用涂布法將稀釋樣品接種在凝固的平板培養(yǎng)基上，后續(xù)方法同前。此法的優(yōu)點是檢測的結(jié)果較為精確，缺點是方法煩瑣，獲得檢測結(jié)果的時間長。 ②液體稀釋法。 對未知樣品作 10倍系列稀釋。選適宜的 3個連續(xù)的 10倍稀釋液各取 5ml，接種到 3組共 15支液體培養(yǎng)基試管中， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 一 .微生物生長量的測定方法 每管接入 lml，培養(yǎng)一定的時間后，記錄每個稀釋度出現(xiàn)生長的試管數(shù)，然后查 MPN(most probable number，最近似數(shù) )表，根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)可計算出其中的活菌含量。原理是在濾紙上有適宜的培養(yǎng)基和活菌指示劑 —— 2， 3， 5氯化三苯基四氮唑 (triphenyl tetrazolium chloride， TTC，無色 )。用刻度吸管取一定的樣品液于濾紙上或浸取樣品液，置于密封包裝袋中， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 一 .微生物生長量的測定方法 經(jīng)短期培養(yǎng)，在濾紙上就會出現(xiàn)一定密度的玫瑰紅色微小菌落。計數(shù)小紅點可計算出樣品的含菌量。單細胞的微生物，可以均勻地分布，每個細胞接觸的環(huán)境條件相同，都有充分的營養(yǎng)物質(zhì)，故每個細胞都迅速生長繁殖。霉菌多數(shù)是多細胞微生物，菌體呈絲狀，在液體培養(yǎng)基中生長繁殖的情況與單細胞微生物不一樣 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 因液體被攪動，菌絲處于分布比較均勻的狀態(tài)，而且菌絲在生長繁殖過程中不會像在固體培養(yǎng)基上那樣有分化現(xiàn)象，孢子產(chǎn)生也較少。 ㈠典型的生長曲線 微生物生長繁殖的速度非?？?，一般細菌在適宜的條件下， 20～30min就可以分裂一次。微生物的菌體數(shù)目，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的開始階段，菌體數(shù)目并不增加， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 一定時間后，菌體數(shù)目增長很快，繼而菌體數(shù)目增長速度保持穩(wěn)定，最后增長速度逐漸下降以致等于零。如果以培養(yǎng)時間為橫坐標，以單細胞增長數(shù)目的對數(shù)值作縱坐標，就可畫出一條生長曲線。這生長曲線 (growth curve)代表單細胞微生物從生長開始到衰老死亡的一般規(guī)律。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 根據(jù)微生物的生長速率常數(shù) (growth rate constant)，即每小時的分裂代數(shù)的不同，一般把典型的生長曲線粗分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個時期。 ⑴延滯期 (lag phase)。又叫適應(yīng)期、緩慢期或調(diào)整期。 是指把少量微生物接種到新培養(yǎng)液開始的一段時間。延滯期細胞數(shù)目不增加， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 甚至還可能減少。延滯期有如下特點：①生長的速率常數(shù)為零；②細胞的體積增大， DNA含量增多，為分裂作準備；③合成代謝旺盛，核糖體、酶類和 ATP的合成加快，易產(chǎn)生誘導酶；④對不良環(huán)境敏感，例如 pH、NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等化學物質(zhì)。 為了提高生產(chǎn)效率，發(fā)酵工業(yè)中常采取措施縮短延滯期，具有十分重要的意義。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 其方法主要有：①以對數(shù)期的菌體作種子菌。因?qū)?shù)期的菌體生長代謝旺盛，繁殖力強，抗不良環(huán)境和噬菌體的能力強，采用對數(shù)期的菌體作種子，延滯期就短。②適當增大接種量。生產(chǎn)上接種量的多少是影響延滯期的一個重要因素。接種量大，延滯期短；接種量小，則延滯期長。一般采用 3％～ 8％的接種量，根據(jù)生產(chǎn)上的具體情況而定， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 最高不超過 10％。③培養(yǎng)基的成分。為了縮短培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分差異，常在種子培養(yǎng)基中加入生產(chǎn)培養(yǎng)基的某些營養(yǎng)成分，即是種子培養(yǎng)基盡量接近發(fā)酵培養(yǎng)基。通常微生物生長在營養(yǎng)豐富的天然培養(yǎng)基中比營養(yǎng)單調(diào)的組合培養(yǎng)基中快。 ⑵對數(shù)期 (logarithmic phase)。又叫指數(shù)期。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 指在生長曲線中，緊接著延滯期后的一段時期。此時菌體細胞生長的速率常數(shù) R最大，分裂快，細胞每分裂一次的增代時間 (即代時，generation time)短，細胞進行平衡生長，菌體內(nèi)酶系活躍，代謝旺盛，菌體數(shù)目以幾何級數(shù)增加 ,群體的形態(tài)與生理特征最一致，抗不良環(huán)境的能力強。 在對數(shù)期中，以下三個參數(shù)尤為重要。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 ①繁殖代數(shù) (n)。 ②生長速率常數(shù) (R)。 ②代時 (G)。 影響微生物對數(shù)期增代時間的因素較多，主要有： ①菌種。不同微生物代時差別大，即使是同一菌種，由于培養(yǎng)基成分和物理條件(如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的 pH和營養(yǎng)物質(zhì)的性質(zhì) )的不同，其對數(shù)期的代時也不同。但是，在一定條件下，各種菌的代時是相對穩(wěn)定的， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 多數(shù)為 20～ 30min，有的長達 33h，快的只有 。 ②營養(yǎng)成分。同種細菌，營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，其代時就短，反之則長。 ③培養(yǎng)溫度。溫度是影響微生物生長速率的重要物理因素。 ⑶穩(wěn)定期 (stationary phase)。又叫最高生長期或恒定期。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 處于穩(wěn)定期的微生物其特點是新繁殖的細胞數(shù)與衰亡細胞數(shù)幾乎相等，即是正生長與負生長達動態(tài)平衡，此時生長速度逐漸趨向于零。 出現(xiàn)穩(wěn)定期的原因主要有①營養(yǎng)物質(zhì)特別是生長限制因子的耗盡，營養(yǎng)物質(zhì)的比例失調(diào)②酸、醇、毒素或過氧化氫等有害代謝產(chǎn)物的累積；③pH、氧化還原電勢等環(huán)境條件越來越不適宜等。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 穩(wěn)定期是以生產(chǎn)菌體或與菌體生長相平行的代謝產(chǎn)物。穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上達到了最高水平，產(chǎn)物的積累也達到了高峰。這時，菌體的總產(chǎn)量與所消耗的營養(yǎng)物質(zhì)之間存在著一定關(guān)系。 ⑷衰亡期 (decline phase或 death phase)。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 穩(wěn)定期后，微生物死亡率逐漸增加，以致死亡數(shù)大大超過新生數(shù)，群體中活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)了 “ 負生長 ”(R 為負值 )，此階段叫衰亡期。有的微生物在這時產(chǎn)生抗生素等次生代謝產(chǎn)物；對于芽孢桿菌，芽孢釋放往往也發(fā)生在這一時期。 ㈡微生物的連續(xù)培養(yǎng) 微生物置于一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過培養(yǎng)一段時間后， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 最后一次性地收獲，稱分批培養(yǎng)。在分批培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是一次性加入，不再補充，隨著微生物的生長繁殖活躍，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，有害代謝產(chǎn)物不斷積累，細菌的對數(shù)生長期不可能長時間維持。 連續(xù)培養(yǎng)的方法主要有兩類： ⑴恒濁法。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 其原理是根據(jù)培養(yǎng)器內(nèi)微生物的生長密度，用光電控制系統(tǒng) (濁度計 )來檢測培養(yǎng)液的濁度 (即菌液濃度 )，并控制培養(yǎng)液的流速，從而獲得菌體密度高、生長速度恒定的微生物細胞的連續(xù)培養(yǎng)液。當培養(yǎng)器中濁度增高時，通過光電控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，可促使培養(yǎng)液流速加快，反之則慢，以此來達到恒密度的目的。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 在恒濁器中的微生物，始終能以最高生長速率進行生長，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度。在生產(chǎn)實踐上，為了獲得大量菌體或與菌體生長相平行的某些代謝產(chǎn)物如乳酸、乙醇時，可采用恒濁法。 ⑵恒化法。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 與恒濁法不同的是，恒化法是使培養(yǎng)液流速保持不變，即控制在恒定的流速，使微生物始終在低于最高生長速率條件下進行生長繁殖的一種連續(xù)培養(yǎng)方法。常通過控制某一種營養(yǎng)物的濃度，使其成為限制性的因子，而其他營養(yǎng)物均為過量，這樣，細菌的生長速率將取決于限制性因子的濃度。隨著細菌的生長，菌體的密度會隨時間的增長而增高， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 而限制性生長因子的濃度又會隨時間的增長而降低，兩者互相作用的結(jié)果，出現(xiàn)微生物的生長速率正好與恒速加入的新鮮培養(yǎng)基流速相平衡。這樣，既可獲得一定生長速率的均一菌體，又可獲得雖低于最高菌體產(chǎn)量，但能保持穩(wěn)定菌體密度的菌體。 連續(xù)培養(yǎng)如用于發(fā)酵工業(yè)中，就稱為連續(xù)發(fā)酵 (continuous fermentation)。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 連續(xù)發(fā)酵與分批發(fā)酵相比有許多優(yōu)點：①自控性，便于利用各種儀表進行自動控制；②高效，它使裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等工藝簡化了，縮短了生產(chǎn)時間和提高了設(shè)備的利用效率；③產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定；④節(jié)約了大量動力、人力、水和蒸汽，使水、汽、電的負荷減少。但也存在不足之處：①主要是菌種易于退化，使微生物長期處于高速繁殖的條件下， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 即使是自發(fā)突變率很低，也難以避免變異的發(fā)生。②容易污染，在連續(xù)發(fā)酵中，要保持各種設(shè)備無滲漏，通氣系統(tǒng)不出任何故障，是極其困難的。因此， “ 連續(xù) ” 是有時間限制的，一般可達數(shù)月至一年、兩年。③連續(xù)培養(yǎng)中，營養(yǎng)物的利用率低于分批培養(yǎng)。 在發(fā)酵工業(yè)中，連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)已廣泛用于酵母單細胞蛋白的生產(chǎn)， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 ㈢同步生長 獲得細菌同步生長的方法主要有兩類：其一是調(diào)整生理條件誘導同步性，主要是通過控制環(huán)境條件如溫度、光線和處于穩(wěn)定期的培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基等來誘導同步；其二是機械法 (又稱選擇法 )，它是利用物理方法從不同步的細菌群體中選擇出同步的群體， 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 二 .微生物的群體生長規(guī)律 一般可用過濾分離法或梯度離心法來達到。在這兩種方法中，由于誘導法可能導致與正常細胞循環(huán)周期不同的周期變化，所以不及選擇法好，這在生理學研究中尤其明顯。影響微生物生長的外界因素很多。當環(huán)境條件的改變，在一定限度內(nèi)，可引起微生物形態(tài)、生理、生長、繁殖等特征的改變 。當環(huán)境條件的變化超過一定極限時，則導致微生物的死亡。 第五章 微生物的營養(yǎng)和生長 三 .影響微生物生長的因素 延長食品的貨架期。 ㈠溫度 溫度是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一。在一定溫度范圍內(nèi)，機體的代謝活動與生長繁殖隨著溫度的上升而增加。當溫度上升到一定程度，開始對機體產(chǎn)生不利的影響，如再繼續(xù)升高，則細胞功能急劇下降以至死亡。 生長溫度的三個基本點。