細(xì)胞工程第十一章、動物組織與胚胎工程(編輯修改稿)
2024-10-08 21:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 0mg， 或經(jīng)陰道海綿栓給予孕酮 50~60mg， 綿羊處理 12~14天 ， 山羊處理 12~18天 ， 在處理的最后一天或撤除海綿栓的前一天 ，給予 PMSG200~250IU， 一般可在停止注射或撤除海綿栓后 2~3天內(nèi)發(fā)情 。 ? 必須用優(yōu)秀的種公畜進行多次配種，一般隔 812小時進行一次配種，直到發(fā)情結(jié)束。 ? 配種前應(yīng)對種公畜的精液進行質(zhì)量檢查。 ? 可優(yōu)秀種公畜不足時，可考慮首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。 羊同期發(fā)情 —— 放栓 供體超排處理 供體配種 ? 胚胎沖洗液的配制：杜氏磷酸緩沖液 PBS， 布林斯特液 SOF合成輸卵管液 ? 手術(shù)法收集胚胎 – 輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚 – 子宮角沖胚 ? 非手術(shù)法收集胚胎 – 二路法 – 三路法 ? 較為適用的是含滅活犢血清磷酸緩沖液(pbs)。 其成分：氯化鈉 8g， 氯化鉀 2g，磷酸氫二鈉 ， 磷酸二氫鉀 ，氯化鈣 ， 氯化鎂 ， 丙酮酸鈉32mg， 葡萄糖 1g， 牛血清白蛋白 4g， 卡那霉素 25mg， 酚紅 5mg， 三蒸餾水1000ml。 犢牛血清 20%， ， 20℃保存。 移胚 配種后 3天的供卵巢 供體羊胚胎收集 ? 收集到的沖洗液靜置，沖洗液分離。 ? 揀胚：將胚胎移至培養(yǎng)液或保存液中。 ? 胚胎鑒定：根據(jù)透明帶、胚胎細(xì)胞、發(fā)育階段及細(xì)胞在透明帶中的比例確定胚胎級別。 6天收集的胚胎（未揀） 二細(xì)胞至四細(xì)胞胚胎 ? 胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長其體外生存時間 ? 體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育 ? 胚胎冷凍：通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中 ? 保存的方法可以分為 非冷凍保存 和 冷凍保存 。 ? 非冷凍保存是 1948年，由 等開創(chuàng)的，他們將兔 2細(xì)胞胚胎，在同種血清中 37℃ 保存 48小時，移植后產(chǎn)仔。 ? 非冷凍保存主要有三種方法，即 異種動物體內(nèi)保存法、卵和胚胎的 37℃ 保存法和冷藏保存法 。 異種動物體內(nèi)保存法 ? 又稱為 中間受體培養(yǎng)法 ，是指把一種動物的胚胎，移入另一種動物的輸卵管或子宮內(nèi)，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的動物都能在另一種動物的輸卵管或子宮內(nèi)存活的。 ? 瓊脂包埋移植法 是指將胚胎移植到 1％的瓊脂液中，用口徑適宜的微吸管把胚胎連同少量瓊脂液一起吸入。當(dāng)瓊脂凝結(jié)后再將其壓出，胚胎就被封入圓柱形瓊脂小柱中，每個瓊脂小柱放 3－ 5枚胚胎，再把這個瓊脂小柱封入較大的％瓊脂圓柱內(nèi)。然后，通過胚胎移植技術(shù)，將瓊脂柱移入中間受體輸卵管中。移植前，預(yù)先結(jié)扎輸卵管與子宮的接合部。 ? 直接移植法 是不經(jīng)瓊脂處理，直接移入預(yù)先結(jié)扎過的受體輸卵管中。經(jīng)過短期培養(yǎng)后，將胚胎從輸卵管內(nèi)沖出 ，觀察發(fā)育情況。對發(fā)育良好者，移植入同期發(fā)情的同種動物受體內(nèi)，使其產(chǎn)仔。 37℃ 保存法 ? 是指在 37℃ 下，短時間保存卵和胚胎。 ? 由于是在胚胎培養(yǎng)的條件下進行，因而應(yīng)當(dāng)考慮到保存時間和胚胎發(fā)育、卵老化等問題。 ? 例如，兔和小鼠的 4－ 6細(xì)胞胚胎，經(jīng)過 96小時在37℃ 保存，已經(jīng)發(fā)育到胚泡階段。一般而言，經(jīng)過 48小時體外保存，再移向受體，胎兒的發(fā)育率要下降 50％，保存時間越長發(fā)育率越下降。 ? 就卵母細(xì)胞而言，排卵或由卵泡取出后，受精能力有一定限度，所以保存時間長，即或能受精，也可能出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常。 冷藏保存法 ? 低于室溫，但還達(dá)不到冷凍階段的溫度對胚胎進行保存即為冷藏保存法，一般在 0－ 10℃ 左右保存。 ? 由于低溫，可以抑制物質(zhì)代謝的速度和細(xì)胞分裂的速度，因之可以延長保存時間 。 冷凍法 ? 冷凍法是指－ 196℃ 保存胚胎，在進行超低溫冷凍前，必須進行冷凍保護劑處理。一般說來，在－ 80℃ 以上時，細(xì)胞則逐漸失去活力，到－ 130℃ 以下，細(xì)胞內(nèi)的水分呈微細(xì)冰晶樣或玻璃樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)所有需要能量的反應(yīng)停止，細(xì)胞的活動也幾乎停止。 ? 最早，小鼠中獲得成功。 冷凍過程中細(xì)胞受到的損害 ? 在冷凍過程中，細(xì)胞會受到兩方面的損害。 ? 快速冷凍時，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶，對細(xì)胞膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機械性損害，這是指冷凍的物理損傷。
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