動(dòng)物細(xì)胞工程教學(xué)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-10 23:39 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 % C0 90%N 5%O2和飽和濕度。 3）培養(yǎng)時(shí)間： 牛和羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的時(shí)間一般為 22～ 24h，而馬為 30～ 36h，豬為 40～ 44h。 4）培養(yǎng)方法： 卵母細(xì)胞體外成熟的培養(yǎng)方法一般采用微滴法、封閉法和開放法三種。 卵母細(xì)胞體外成熟的標(biāo)志及特征 ? （ 1）生發(fā)泡破裂 ? （ 2）染色體凝集 ? （ 3）紡錘體形成 ? （ 4）第一極體排出 ? （ 5）透明帶軟化 ? （ 6）卵丘細(xì)胞擴(kuò)展 影響卵母細(xì)胞體外成熟的因素 動(dòng)物種類 卵母細(xì)胞的類型 卵母細(xì)胞和卵泡的大?。?— 2mm） 卵巢運(yùn)輸和季節(jié)（ 6h， 30 ℃ ，繁殖季節(jié)） （ 2）培養(yǎng)環(huán)境 溫度 時(shí)間 氣相 培養(yǎng)基 （ 3）生化因子 Ca2+ 甾類激素 （ LH可誘導(dǎo)卵母 細(xì)胞成熟，而雄 激素和 PG則可抑制卵母細(xì)胞成熟） 卵母細(xì)胞成熟抑制因子 （ 1）卵母細(xì)胞的來源 幾種動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的方法 （ 1）小鼠 A、培養(yǎng)液： ++100IUPMSG或者 T6液 +4mg/mlBSA ① 于當(dāng)天上午對(duì)小鼠皮下注射 5IUPMSG， 促進(jìn)卵泡發(fā)育； ② 注射 PMSG46h后頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘出卵巢 ③在表面皿中 — TYH/HEPES液， 在體視顯微鏡下刺破卵泡 ④選擇充分發(fā)育的卵母細(xì)胞，在石蠟液滴（ 50—100ul/10— 20個(gè)卵母細(xì)胞）中培養(yǎng) B、方法 （ 2）牛、羊 A、培養(yǎng)液： TCM199+25mmol/LHEPES+%FBS+FSH++E2+雙抗或者TCM199++50mg/L慶大霉素++LH++%PVP B、方法： ① 從屠宰場獲取牛卵巢后，放入 25— 30 ℃ DPBS或生理鹽水中加雙抗的保溫瓶中立即帶回實(shí)驗(yàn)室； ②從卵巢表面吸取 2— 8mmCOC； ③放入石蠟液滴中培養(yǎng)， 22— 26h， C02培養(yǎng)箱 三、精子獲能 概念 精子在通過附睪時(shí)已經(jīng)獲得了受精能力，但由附睪分泌的一種物質(zhì)覆蓋在頂體表面，抑制了其受精能力，這種物質(zhì)叫做去能因子。 精子在雌性生殖道或體外培養(yǎng)液中停留一段時(shí)間后，去能因子的作用被解除，精子在生理上和形態(tài)上發(fā)生一系列變化并獲得受精（穿透卵子）能力的生物學(xué)現(xiàn)象，叫之。能夠解除去能因子的物質(zhì)稱為獲能因子。 精子獲能的途徑 目前，精子體外獲能的途徑主要有高離子強(qiáng)度處理法、高 PH處理法、鈣離子載體處理法、肝素處理法、咖啡因處理法以及添加牛卵泡液、子宮液和輸卵管液等。 哺乳動(dòng)物精子獲能的模型 1）高離子強(qiáng)度處理法 Oliphant和 Brackett（ 1973）首先用高離子強(qiáng)度液使小鼠精子體外獲能。隨后， 他們（ 1975）在特定培養(yǎng)液 (BrackettOliphant， BO液 )，或稱限定培養(yǎng)液 (defined media, DM)液中加入 NaCL／mL，從而使 NaCL濃度高達(dá) 170 mmol/L、滲透壓為380mOsm、以此 HIS處理家免精子 15min體外受精后獲得了試管兔。以相同的方法處理牛精子，與成熟卵泡卵母細(xì)胞體外受精后移植，獲得了試管牛(Brackettt等， 1982)。 HIS液可以置換精子表面抗原物質(zhì)或去能因子，從而誘發(fā)頂體反應(yīng)。 精子的頂體反應(yīng)是一個(gè)鈣離子依賴過程。 IA（ A23187）與鈣離子形成復(fù)合物，攜帶鈣離子進(jìn)入精子內(nèi)，可誘發(fā)頂體反應(yīng)并激活頂體酶。如果在處理中添加咖啡因，則獲能效果更好，但 IA 對(duì)精子作用很強(qiáng)烈，處理時(shí)間過長或濃度過高都會(huì)導(dǎo)致精子急劇死亡。對(duì)不同動(dòng)物的精子在 IA濃度、處理時(shí)間和咖啡因濃度方而進(jìn)行了詳細(xì)研究，確定了最優(yōu)化獲能條件。 2）鈣離子載體 GAGs可促進(jìn)精子對(duì)鈣離子的吸收，誘發(fā)頂體反應(yīng)。不同類型的 GAGs對(duì)精子獲能的作用程度不同，這種獲能作用有賴于氨基多糖的硫酸化程度。肝素是硫酸化程度最高的 GAGs，其誘導(dǎo)精子獲能的作用最強(qiáng)。肝素濃度以 10— 20ug／ mL為宜，處理時(shí)間為5— 60min，如再加入咖啡因，還可提高獲能效果。 ? 此外，幾乎在各種動(dòng)物的精子獲能中均以 BSA作為輔助成分， BSA可以改變 (除去 )精子膜上的膽固醇含量，降低精子膜上膽固醇 /磷脂比率，改變精子膜的穩(wěn)定性，發(fā)生頂體反應(yīng)。 BSA還對(duì)精子活力和超活化運(yùn)動(dòng)有維持作用，精子一旦獲能， BSA可促進(jìn)其迅速穿透卵子。 3）氨基多糖法 受精液： 通常使用 Tyrode’s 改良液和 BO液 受精方法： 微滴法 、四孔培養(yǎng)板法 精卵共培養(yǎng)的時(shí)間、溫度和氣相： 受精后，卵母細(xì)胞應(yīng)立即放入溫度 39℃ ，含 5％ CO2的空氣和最大相對(duì)濕度的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24～ 44h，其中牛 22～ 24h，將假定的受精卵從
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