細(xì)胞工程第十一章、動(dòng)物組織與胚胎工程-預(yù)覽頁
【正文】 時(shí)間應(yīng)接近或一致 2. 超數(shù)排卵處理 ? 利用促性腺激素處理，使得卵巢中有更多的卵泡發(fā)育，更多的卵被排出，這個(gè)過程就稱為超數(shù)排卵（ superovulation） ? 意義：讓每個(gè)供體提供更多的胚胎 ? 處理時(shí)間： – 牛：預(yù)計(jì)自然發(fā)情時(shí)間的前 4天，或發(fā)情周期的第 1617天 – 羊：發(fā)情周期的第 1215天，促性腺激素處理的第二天或第三天，注射 PG 同期發(fā)情與超排程序 放栓 發(fā)情鑒定 配種 0123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 7:00 FSH 4ml 18:00 FSH 4 ml 7:00 FSH 18:00 FSH 7:00 FSH 2ml 14:00 PG6ml 18:00 FSH 2ml 7:00 FSH 14:00 取栓 18:00 FSH 配種 配種 檢查黃體 沖胚移胚 ? 1）母牛發(fā)情后 9— 13天開始肌肉注射促卵泡素 (FSH)， 每次劑量為 50IU， 每天兩次，每次間隔 12h， 連續(xù)注射 4天，共 8次。 受體同期發(fā)情處理 ? 1)前列腺素處理法：有溶黃體作用 – 在發(fā)情周期的第 9天以后 ， 注射 PG2α （ 牛 ,羊 )。 – 羊：每日肌注孕酮 10~20mg， 或經(jīng)陰道海綿栓給予孕酮 50~60mg， 綿羊處理 12~14天 ， 山羊處理 12~18天 ， 在處理的最后一天或撤除海綿栓的前一天 ，給予 PMSG200~250IU， 一般可在停止注射或撤除海綿栓后 2~3天內(nèi)發(fā)情 。 羊同期發(fā)情 —— 放栓 供體超排處理 供體配種 ? 胚胎沖洗液的配制：杜氏磷酸緩沖液 PBS， 布林斯特液 SOF合成輸卵管液 ? 手術(shù)法收集胚胎 – 輸卵管沖胚：順向沖胚、逆向沖胚 – 子宮角沖胚 ? 非手術(shù)法收集胚胎 – 二路法 – 三路法 ? 較為適用的是含滅活犢血清磷酸緩沖液(pbs)。 ? 揀胚：將胚胎移至培養(yǎng)液或保存液中。 ? 非冷凍保存主要有三種方法，即 異種動(dòng)物體內(nèi)保存法、卵和胚胎的 37℃ 保存法和冷藏保存法 。然后，通過胚胎移植技術(shù)，將瓊脂柱移入中間受體輸卵管中。對(duì)發(fā)育良好者，移植入同期發(fā)情的同種動(dòng)物受體內(nèi)，使其產(chǎn)仔。一般而言，經(jīng)過 48小時(shí)體外保存，再移向受體，胎兒的發(fā)育率要下降 50％，保存時(shí)間越長發(fā)育率越下降。 冷凍法 ? 冷凍法是指－ 196℃ 保存胚胎，在進(jìn)行超低溫冷凍前，必須進(jìn)行冷凍保護(hù)劑處理。 ? 快速冷凍時(shí)，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶，對(duì)細(xì)胞膜和內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機(jī)械性損害，這是指冷凍的物理損傷。 ? 冷凍保護(hù)劑的加入，可保護(hù)細(xì)胞抵抗低溫對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害。 動(dòng)物胚胎的一般保存程序 ? 動(dòng)物胚胎的一般保存程序是將胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷卻到 0℃ ，逐漸加入冷凍保護(hù)劑，封閉安瓿。解凍速度也不超過 25℃/ 分鐘。該方法能較好地克服胚胎脫水少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成之間的矛盾，獲得較高的存活率。該法適用于冷凍胚胎運(yùn)輸使用。讓一個(gè)胚胎垂直位于另一胚胎之上，借機(jī)械壓力和 PHA的作用，更易聚合。當(dāng)用兩個(gè)無透明帶胚胎時(shí)，以類似 “ 三明治 ” 的方式，把細(xì)胞放到兩個(gè)胚胎之間，使之聚合。 囊胚注射法 把某些種類細(xì)胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的細(xì)胞可以是卵裂球、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞，甚至是已經(jīng)分化的細(xì)胞。將 10－ 12個(gè)細(xì)胞吸入到注射吸管的頂端。操作后的囊胚形態(tài)不規(guī)則，經(jīng)短期培養(yǎng)后，可以恢復(fù)正常狀態(tài)?；蛘咴诔錾鷷r(shí)，檢查眼瞼色素情況，確定是否是嵌合體。 經(jīng) GPI染液染色，可顯示出同工酶譜帶。 三、胚胎分割 ? １、胚胎分割的原理 ? 根據(jù)卵裂球具有發(fā)育成為一個(gè)個(gè)體的全能性的特點(diǎn)，人們就考慮用這種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，生產(chǎn)同卵雙胎或多胎，以加速優(yōu)良種群的繁殖。 ? 對(duì)研究卵裂球位置與分化方向以及研究嵌合胚、不同卵裂球遺傳性等，都是一種很有用的技術(shù)。將微吸管自切口處伸入，吸住半數(shù)卵裂球，慢慢取出，這樣即可以把胚胎一分為二。依照同樣的方法，可以將胚胎分割成為四或八分胚。然后自胚胎的等分線向下移動(dòng)，把胚胎輕輕壓住，繼續(xù)下切，胚胎就被壓扁，繼而被切開。 過程 胚胎分割
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