細胞工程第十一章、動物組織與胚胎工程(文件)
【正文】 使之聚合。通過中間受體培養(yǎng)一段時間后，觀察其發(fā)育的情況。如果是培養(yǎng)細胞，應該保證其整二倍體性。將細胞推入囊胚腔，使之落到內(nèi)細胞團之上。幼鼠生下 4－5天后，就可以分析其膚色或毛色，懷孕 10天左右的小鼠胎兒，眼睛就有色素沉積。 ? 現(xiàn)在比較常用的是磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（ GPI） 分析，其原理是果糖－ 6－磷酸在 GPI作用下，產(chǎn)生葡萄糖－ 6－磷酸，在 6－磷酸葡萄糖脫氫酶和 NADP作用下，使 G－ 6－ P成為 6－磷酸葡萄糖酸鹽，NADP還原為 NADPH。 胚胎嵌合的意義 胚胎嵌合技術可以作為研究分析哺乳動物發(fā)生機制的重要手段，例如研究卵裂球分化潛力，研究性分化機制與性比，研究 X染色體失活及其作用和研究胚胎細胞基因表達的機制；也可以對生理功能分析的應用，例如對免疫功能、遺傳病的研究分析；還可以培育雜種個體，甚至是種間雜種；可以通過制作各種組合的嵌合體，培育新的毛皮動物；利用種間移植，分析胎兒和母體的相互關系。 ? 這種方法已經(jīng)在牛、羊、馬生出同卵多胎。在顯微操作儀上，用固定吸管固定住胚胎，然后用微玻璃針自上而下切開透明帶，使其成為一個切口。然后將分割后的胚胎包入瓊脂柱，通過中間受體培養(yǎng)。 ５、過程 ? 把經(jīng)過軟化處理的胚胎，與少量培養(yǎng)液一起置于載片上，把針或微刀的刃部調(diào)節(jié)到胚胎的正上方。相對而言，二分胚、四分胚比較容易培養(yǎng)，而八分胚的存活率很低。再把切割的胚胎納入空透明帶。 ４、桑椹期的胚胎分割 ? 用微玻璃針或微刀進行分割，無需固定吸管，由于透明帶韌性較強。把吸出的半胚或卵裂球，納入空透明帶中。 ３、致密化以前各期的胚胎分割 ? 對于致密化以前各期的胚胎，由于卵裂球之間彼此尚未建立起緊密聯(lián)系，分割時較容易進行。 ? 胚胎的分割在不同時期有不同的分離培養(yǎng)方法，如卵裂球分離培養(yǎng)法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。 ? 分析時，從嵌合動物中取不同組織器官，勻漿后制成電泳樣本，在醋酸纖維素板上點樣，電泳、染色處理。 使用同工酶分析 ? 首先分析動物特定的同工酶譜系，然后選擇具有不同圖譜的兩種或多種動物作為供體動物提供胚胎。 有色鼠與白色鼠胚胎融合 胚胎 嵌合 的鑒定 兩種：色素分析法和遺傳分析法 色素分析法簡單、直觀，比較實用。用固定吸管吸住內(nèi)細胞團與滋胚層交界處，讓內(nèi)細胞團位于囊胚的底部位置。若注入的細胞參與胚體的形成，那么就形成了嵌合體。 第三種利用兩種細胞間聚合。若放到37℃ 時，效果更佳，聚合完畢后，洗除PHA， 繼續(xù)培養(yǎng)，或進行胚胎移植。 ? 快速冷凍法 將胚胎或卵母細胞在適當?shù)睦鋬霰Ｗo劑混合液中作短暫處理后，直接投入液氮。解凍后，用蔗糖洗脫。其優(yōu)點是脫水完全，細胞內(nèi)不易形成冰，但比較費時，冷凍保護劑對胚胎作用時間長。然后，把封閉好的安瓿從 0℃ 冰室，轉(zhuǎn)移到－ 5－ 6℃ 的恒冷室中，用預先在液氮凹面冷卻的眼科鑷子尖部，接觸安瓿，玻璃上一出現(xiàn)霜，就立即移開鑷子，完成植冰過程，之后，慢速冷至－ 40℃ 或－ 70℃ ，再直接投入液氮中保存。在胚胎冷凍過程中，還需要在稍低于溶液冰點時，強行致冷，防止溶液過冷現(xiàn)象的發(fā)生，這種促使溶液結(jié)冰的方法稱為 誘發(fā)結(jié)晶或植冰（ seeding）。 ? 當緩慢降溫時，細胞內(nèi)的水，有足夠的時間完全滲到外面，從冰點緩慢降到細胞完全脫水，往往需要幾個小時或更長時間，細胞一直處于高濃度溶質(zhì)中。一般說來，在－ 80℃ 以上時，細胞則逐漸失去活力，到－ 130℃ 以下，細胞內(nèi)的水分呈微細冰晶樣或玻璃樣結(jié)構(gòu)，細胞內(nèi)所有需要能量的反應停止，細胞的活動也幾乎停止。 ? 就卵母細胞而言，排卵或由卵泡取出后，受精能力有一定限度，所以保存時間長，即或能受精，也可能出現(xiàn)胚胎發(fā)育異常。 37℃ 保存法 ? 是指在 37℃ 下，短時間保存卵和胚胎。移植前，預先結(jié)扎輸卵管與子宮的接合部。 異種動物體內(nèi)保存法 ? 又稱為 中間受體培養(yǎng)法 ，是指把一種動物的胚胎，移入另一種動物的輸卵管或子宮內(nèi)，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的動物都能在另一種動物的輸卵管或子宮內(nèi)存活的。 ? 胚胎鑒定：根據(jù)透明帶、胚胎細胞、發(fā)育階段及細胞在透明帶中的比例確定胚胎級別。 其成分：氯化鈉 8g， 氯化鉀 2g，磷酸氫二鈉 ， 磷酸二氫鉀 ，氯化鈣 ， 氯化鎂 ， 丙酮酸鈉32mg， 葡萄糖 1
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