基因工程第四章目的基因的分離和合成(編輯修改稿)
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【文章內(nèi)容簡介】 Oligo（ dT）引導(dǎo)的 cDNA合成法 ? 隨機(jī)引物引導(dǎo)的 cDNA合成法 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 二、 cDNA基因文庫的構(gòu)建 3. 雙鏈 cDNA分子的合成 ? 自我引導(dǎo)合成法 ? 堿處理 mRNAcDNA雜交分子，降解 mRNA ? 單鏈 cDNA在 3‘ 端易發(fā)生自身環(huán)化形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)為 cDNA第二鏈的合成提供引物 ? 在 klenow酶的作用下合成 cDNA第二鏈 ? 用 S1酶切割除去單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu) 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 二、 cDNA基因文庫的構(gòu)建 3. 雙鏈 cDNA分子的合成 ? 置換合成法 ? RNA酶 H和 DNA聚合酶 I混合處理 mRNAcDNA雜交分子， RNA酶 H在雜合雙鏈 mRNA鏈上產(chǎn)生缺口并形成部分 cDNA單鏈區(qū) ? DNA聚合酶 I以殘存的 mRNA作為引物合成 cDNA第二鏈 ? T4DNA連接酶修復(fù)缺口 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 二、 cDNA基因文庫的構(gòu)建 3. 雙鏈 cDNA分子的合成 ? 引物合成法 ? 在第一鏈合成完畢后，變性殘留的 mRNA，用末端轉(zhuǎn)移酶在 cDNA游離的 3‘ 羥基端添加同聚物（ dC）末端 ? 將其與人工合成的 oligodG退火，形成引物結(jié)構(gòu) ? 在 klenow酶的作用下，合成第二條 cDNA鏈。 ? PCR法 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 二、 cDNA基因文庫的構(gòu)建 雙鏈平頭的 cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中： 平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收 平頭兩端分別接同聚物尾，最好是 AT同聚物尾，這樣重組 分子可通過加熱局部變性和 S1核酸酶處理回收插入片段 加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 二、 cDNA基因文庫的構(gòu)建 5. 雙鏈 cDNA克隆的篩選 ? 探針原位雜交法 ? 差示雜交法 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 cDNA法克隆目的基因的局限性 并非所有的 mRNA分子都具有 polyA結(jié)構(gòu) 細(xì)菌或原核生物的 mRNA半衰期很短 mRNA在細(xì)胞中含量少，對酶和堿極為敏感， 分離純化困難 僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 三、 PCR擴(kuò)增法 PCR（ Polymerase Chain Reaction）法，又稱為聚合酶 鏈反應(yīng)或 PCR擴(kuò)增技術(shù)，是一種高效快速的體外 DNA聚合程序 使用 PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴(kuò)增目的 基因或 DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必 需的雙引物 PCR法定向擴(kuò)增目的基因的基本原理 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 四、基因的化學(xué)合成 1. DNA的化學(xué) DNA合成儀 2. 酶促法 ? 全片段酶促連接法 ? 人工合成組成一個(gè)完整基因的所有寡核甘酸片段，相鄰的片段間有 46個(gè)堿基的重疊互補(bǔ) ? 相互互補(bǔ)的寡核甘酸片段復(fù)性，形成雙鏈寡核甘酸片段 ? 用 T4連接酶連接 ? 酶促填充法 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 四、基因的化學(xué)合成 1. DNA的化學(xué) DNA合成儀 2. 酶促法 ? 全片段酶促連接法 ? 酶促填充法 ? 合成目的基因其中的一些片段，在這些相鄰的片段的 3‘ 端有一短的序列互補(bǔ) ? 復(fù)性形成模板 ? 用 klenow酶去填補(bǔ)互補(bǔ)片段間的單鏈區(qū)域 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略 全基因合成 上述三種方法各有利弊：化學(xué)合成 DNA的 單片段愈短，收率就愈高，但由于化學(xué)合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時(shí)，雖然化學(xué)合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學(xué)合成的收率極低，例如，每聚合一個(gè)單體的產(chǎn)物收率為 95%則合成 50個(gè)堿基長的 DNA單鏈大片段的總收率只有% 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略 探針等寡聚核苷酸合成 在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產(chǎn)物的部分氨基酸 序列，而基因序列未知，此時(shí)需要從已知的氨基酸序列推測為其 編碼的 DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或 cDNA法得到 的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子 由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設(shè)計(jì)時(shí) 必須考慮下列問題： 生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針 探針應(yīng)具有足夠的長度，通常在 1720個(gè)核苷酸之間 探針內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)可能的互補(bǔ)區(qū)域 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 化學(xué)合成的單元操作 化學(xué)合成 DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去 ，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng) ， 包括：基團(tuán)保護(hù) 、 分離 、 縮合 、 分離 、去保護(hù)五大操作單元 。 從反應(yīng)機(jī)理上來講， DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸液三酯法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便， DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計(jì)的 2022/9/20 蘇州科技學(xué)院生物系 葉亞新 DNA化學(xué)合成的用途 合成天然基因 修飾改造基因 設(shè)計(jì)新型基因
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