基因工程實驗biochemlab(編輯修改稿)
2024-10-08 20:45 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 l 10μmol/L primer 2 1ul 模板 1ul Taq酶 總體積 30ul 四、實驗步驟 ２、在離心機中混勻。 ３、ＥＰ管放入ＰＣＲ儀中，按照原理中的條件設(shè)置程序，進行ＰＣＲ反應(yīng)。 ４、 PCR結(jié)束后，取 3ul PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 五、思考題 PCR中產(chǎn)生非特異性條帶的原因可能有哪些？ 實驗四 凝膠電泳法回收目的DNA及其體外連接 一、實驗?zāi)康? 1. 學(xué)習(xí)和掌握從瓊脂糖凝膠中回收 DNA片段的方法。 2. 掌握 DNA體外連接的方法。 二、實驗原理 1. DNA分子在瓊脂糖凝膠中的電泳速率與以下因素有關(guān) ? DNA分子大小 ? DNA分子構(gòu)象 ? 瓊脂糖凝膠濃度 ? 電泳所用電壓 ? 電泳緩沖液 ? 2. 利用硅膠膜在高鹽濃度時能特異性吸附 DNA，而在低鹽濃度時可使 DNA被洗脫的原理純化 DNA。 3. Taq酶參與 PCR反應(yīng)中，產(chǎn)物雙鏈核酸中的 3’端各多連接一個脫氧腺苷酸 A，與商業(yè)開發(fā)的 pMD18T載體可在 DNA連接酶作用下，按照堿基配對形成環(huán)狀的完整質(zhì)粒。 ? 生物化學(xué)資料網(wǎng) 三、實驗用具及試劑 凝膠電泳系統(tǒng)，刀片，紫外儀，酒精燈 EP管， EP管架， 65℃ 水浴鍋 PCR產(chǎn)物， 1 TBE，加樣緩沖液， TakaRa膠回收試劑盒， TA克隆試劑盒， DL2022 marker ? 1. 2%瓊脂糖凝膠電泳 2. 在紫外燈下用干凈的手術(shù)刀割下含有目的 DNA瓊脂糖塊裝在 EP管中稱量減 1克即為凝膠塊重量 3. 加入 5個凝膠體積量的 DRⅠ Buffer 4. 混勻 65℃ 加熱融化凝膠塊 5. 加入 DRⅠ Buffer量的 1/2 體積的 DRⅡ Buffer, 當(dāng)目的片段小于 400bp再加入終濃度為 20% 的異丙醇 6. 將上述溶液 short后轉(zhuǎn)移至 spin coloumn中 12022rpm, 1min 棄濾液 7. 加入 500ul RinseA 12022rpm 30s 棄濾液 8. 加入 700ul RinseB 12022rpm 30s棄濾液 9. 同 8 四、實驗步驟 10. 將 spin coloumn安置于新的 EP管中 在 spin coloumn膜中央加 25ulElution Buffer 放入烘箱 1min 12022rpm 1min 保存 EP管 1%膠檢測 11. 鏈接反應(yīng)（冰上操作） 在一支 ml EP管中加入以下試劑： 純化的目的 DNA片段 Vector 連接液 5ul 混勻 16℃ 連接過夜 五、思考題 為什么連接反應(yīng)的溫度要定在 16度？ ? 實驗五 感受態(tài)細胞的制備 1. 掌握感受態(tài)細胞的制備方法 2. 學(xué)習(xí)和理解影響細胞感受態(tài)的因素 一、實驗?zāi)康? ? 感受態(tài)是指受體（或者宿主）細胞最易接受外源DN
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