【文章內(nèi)容簡介】 時(shí)要終止反應(yīng)，則空白可先加終止反應(yīng)試劑再加酶）。 ? 酶空白 ? 底物空白 35 二、底物與產(chǎn)物的測定方法 （酶反應(yīng)的檢測方法） 化學(xué)方法 ：用化學(xué)法測定其中某一底物或產(chǎn)物的變化值。 ? 分光光度法 ： 常用的有 比色法 和 紫外分光光度法 。 ? 熒光測定法： 簡單 、 靈敏 、 快速 。 ? 電化學(xué)分析法 ? （ 1） 離子選擇性電極分析法 ? （ 2） 微電流法 ? 其他方法 ? 如測定氣體的測壓法 ， 測定產(chǎn)物旋光度變化值的旋光測定法 。 酶活力測定反應(yīng)的檢測方法 按照酶法分析方法測定酶活性時(shí)，需要跟蹤酶促反應(yīng)中某一反應(yīng)底物或產(chǎn)物的濃度隨時(shí)間發(fā)生的變化量（速度法），或測量酶促反應(yīng)中反應(yīng)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量（終點(diǎn)法）?？舍槍?duì)某些易于測定的酶促反應(yīng)底物或產(chǎn)物選擇具體的檢測方法，包括容量分析法、氣體檢測法、光學(xué)檢測法、黏度測定法、酶聯(lián)免疫法等。 分光光度法 若酶促反應(yīng)中，反應(yīng)底物或產(chǎn)物之一由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，其吸光度的強(qiáng)度發(fā)生變化，可以通過測定該酶促反應(yīng)系統(tǒng)的光吸收度的變化量，推算出酶的活力。多數(shù)酶類藥物的含量檢測（效價(jià)測定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、門冬酰胺酶、溶菌酶等。 37 三、測定條件的選擇 ? 單因素選擇 ? 正交設(shè)計(jì) —— 多因素選擇 38 單因素選擇－比色法測溶菌酶活性 ? 以染料艷紅 K2BP標(biāo)記的 MLysodeikticus 為底物 ， 分解后產(chǎn)生游離染色碎片 （ 產(chǎn)物 ） ? 離心除去未分解底物 ，上清液比色 ? 吸收度為溶菌酶活力的函數(shù) 。 39 測定條件選擇－ S pH ? （ 1） 酶反應(yīng) 底物濃度 曲線 ? 以染料標(biāo)記的 MLysodeikticus為底物 ， 酶量為 20μg時(shí) ， 1%底物濃度已接近使酶飽和 。 ? （ 2） 酶反應(yīng) PH曲線 ? 磷酸緩沖液和檸檬酸 — 磷酸緩沖液 。 ? 不同組分的緩沖液 ， 其最適 PH稍有不同 ， 選用 液 。 40 測定條件選擇－離子強(qiáng)度 、反應(yīng)時(shí)間及 [E] ? （ 3） 離子強(qiáng)度 對(duì)酶反應(yīng)的影響 ? 離子強(qiáng)度在 ，選用 。 ? （ 4） 酶反應(yīng)過程曲線 (反應(yīng)時(shí)間 )和 酶濃度 曲線 ? 酶量為 20 μg時(shí) ， 反應(yīng)在 30分鐘以內(nèi) ， 吸收度與反應(yīng)時(shí)間有良好的線性關(guān)系 ， 測定系統(tǒng)選用 15分鐘 。 ? 酶量在 50μg之內(nèi) ， 吸收度與酶濃度具有線性關(guān)系 。 41 測定條件 ? 1%染色菌體 緩沖液 1ml ? 37℃ 水浴保溫約 5分鐘 ? 加 酶試樣 15分鐘 ? 加入酸 /乳化劑混合液 2ml，終止反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)離心，上清液于 540nm比色，所得吸收度從酶濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出試樣中溶菌酶含量。 42 二、正交設(shè)計(jì)－多因素選擇 ? 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（ Orthogonal experimental design）是一種高效的 利用正交表來安排多因素多水平設(shè)計(jì)試驗(yàn) 的方法。 ? 通過巧妙的安排和分組， 用較少的試驗(yàn)次數(shù)，就能 分析各因素的作用大小 ，找出最佳的試驗(yàn)條件。 ? 利用各因素所對(duì)應(yīng)指標(biāo)的 極差 R及平均極差 D作出判斷。 43 正交試驗(yàn)優(yōu)選中性蛋白酶活力測定條件 ? 中性蛋白酶是一種 蛋白水解酶 ， 活力測定以 酪蛋白為底物 ， 水解產(chǎn)物與福林試劑在堿性情況下反應(yīng)生成有色物質(zhì) ， 于 680nm處測定吸收值 。 ? 中性蛋白酶作用受 緩沖液的 pH值 、 底物濃度 、反應(yīng)時(shí)間 及 酶濃度 等因素的影響 。 ? 供試品： %的中性蛋白酶溶液 。 ? 底物：酪蛋白 44 實(shí)驗(yàn)方案 ? 實(shí)驗(yàn)取四個(gè)因素： PH值、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間、酶濃度 。 ? 每個(gè)因素選三水平，屬于多因素多水平，為此選用 L9（ 34） 正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 45 46 正交試驗(yàn)表 ? 實(shí)驗(yàn)號(hào) A 緩沖液 pH 值 B 底物濃度 (%) C 反應(yīng)時(shí)間 (min) D 酶濃度 （ U/ml） 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 47 正交實(shí)驗(yàn)安排表 ? ? 48 正交實(shí)驗(yàn)安排表 49 各因素試驗(yàn)值計(jì)算結(jié)果 ? 平均極差越大，對(duì)應(yīng)的因素影響越大。 ? 緩沖液 PH值 ，底物濃度 %，酶濃度用100U/ml為最佳反應(yīng)條件。 ? 反應(yīng)時(shí)間為 10， 20， 30min，對(duì) OD值無顯著影響。 50 各因素試驗(yàn)值的方差分析 結(jié)論： PH值 （ A） 、 底物濃度 （ B） 、 酶濃度 （ D） 為非常顯著因子； 反應(yīng)時(shí)間 （ C） 為非顯著因子 。 51 第五節(jié) 酶類藥物的檢測 ? 肽鍵水解酶 ? 脂鍵水解酶 ? 糖苷鍵水解酶 ? 其它（超氧化物歧化酶） 52 一、肽鍵水解酶 ? 胰蛋白酶 ? 彈性蛋白酶 ? 尿激酶 53 54 胰蛋白酶 （ Trypsin） ? 胰蛋白酶 （ Trypsin） ：由 動(dòng)物胰臟中提取的一種蛋白水解酶 。 ? 牛胰蛋白酶： 223個(gè)氨基酸 ， 分子量 24000， 等電點(diǎn)。 ? 豬胰蛋白酶： 214個(gè)氨基酸 ， 分子量 23400， 等電點(diǎn)。 ? 胰蛋白酶最適 pH為 ~， 電泳純的胰蛋白酶的比活為 8000單位 /mg。 55 胰蛋白酶 56 胰蛋白酶 57 原理 ? 胰蛋白酶專一作用于賴氨酸 、 精氨酸等 堿性氨基酸 的羧基組成的 肽鍵 、 酰胺鍵及酯鍵 ， 水解速度為 酯鍵 酰胺鍵 肽鍵 。 ? BAEE(BenzoylLArginineEthylEster) ? BAA(BenzoylLArginineAnide) ? 苯甲酰－ L－精氨酸乙酯 （ BAEE） 在胰蛋白酶的作用下 ，酯鍵被水解生成苯甲酰－ L－精氨酸 ， 在 253nm波長處的吸收度隨酶促反應(yīng)遞增 ， 因此連續(xù)記錄不同時(shí)間的產(chǎn)物生產(chǎn)量 ， 根據(jù)活力單位定義計(jì)算酶