第三章-核酸擴(kuò)增技術(shù)課件(編輯修改稿)
2024-09-11 23:37 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 微量分析 （四） DNA序列測定 （五）基因突變分析 四、 PCR的主要用途 現(xiàn)在位置 P 目 錄 第二節(jié) 以 PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù) 目 錄 （一）逆轉(zhuǎn)錄 PCR技術(shù) （二）巢式 （三） 定量 PCR技術(shù)（＊＊＊＊＊） （四）多重 PCR技術(shù) （五） PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變 （六）原位 PCR技術(shù) （七）差異顯示 PCR技術(shù) （ X）免疫 PCR技術(shù) 現(xiàn)在位置 P174 以 PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù) 目 錄 （一）、逆轉(zhuǎn) 錄 PCR ? 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（ reverse transcription PCR, RTPCR）是以細(xì)胞內(nèi) 總 RNA或 mRNA為材料進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。 ? 由于耐熱的 DNA聚合酶不能以 RNA或 mRNA作為模板，因此首先必須將總 RNA或 mRNA作逆轉(zhuǎn)錄，以生成與之互補(bǔ)的cDNA，然后 再以 cDNA作為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ，得到所需的目的基因片段。 ? RTPCR主要用于 克隆 cDNA、 合成 cDNA探針 、 檢測 RNA病毒和分析基因表達(dá) 等。 現(xiàn)在位置 174 目 錄 （二）、巢式 PCR ?巢式 PCR（ nested PCR）是對(duì)靶基因進(jìn)行 二次擴(kuò)增 。 ?二次擴(kuò)增所用的引物不能相同，第二次擴(kuò)增所用的引物必須位于第一次擴(kuò)增所用引物的 內(nèi)側(cè) ?先用第一對(duì)引物擴(kuò)增出一個(gè)較大的片段，再用第二對(duì)引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增 ?第二次擴(kuò)增的模板是第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物 現(xiàn)在位置 174 目 錄 （二）、巢式 PCR 現(xiàn)在位置 174 引物 1 引物 2 nest 要擴(kuò)增的目標(biāo)基因 目 錄 （三）、定量 PCR ?相對(duì)定量 PCR ?定量 PCR（實(shí)時(shí)熒光 PCR） 現(xiàn)在位置 175 目 錄 （四）多重 PCR技術(shù) 多重 PCR（ multiplex PCR）即在 同一反應(yīng)體系 中加入 多對(duì)引物 ，以 同時(shí)擴(kuò)增一份 DNA樣品中多個(gè)不同序列的靶片段 。 現(xiàn)在位置 P179 目 錄 （四）多重 PCR技術(shù) ?多重 PCR必須滿足的兩個(gè)條件： ? PCR反應(yīng)條件適合所有被擴(kuò)增的 DNA片段 ? 同一反應(yīng)內(nèi)各擴(kuò)增片段的大小應(yīng)不同，以便檢測時(shí)能通過電泳將各片段充分分離 現(xiàn)在位置 P179 目 錄 （四）多重 PCR技術(shù) 現(xiàn)在位置 P179 目 錄 （四）多重 PCR技術(shù) 現(xiàn)在位置 P179 目 錄 （五） PCR誘導(dǎo)定點(diǎn)突變 DNA重組技術(shù)使我們能夠首先用各種方法對(duì)克隆的 DNA片段進(jìn)行突變，在對(duì)產(chǎn)生的突變作 DNA序列分析以后，再對(duì)突變體的特殊功能作進(jìn)一步研究。 現(xiàn)在位置 P180 目 錄 （六）原位 PCR技術(shù)（ in situ PCR） 組織固定處理 細(xì)胞內(nèi)的 DNA或 RNA，并以其作為靶序列進(jìn)行 PCR反應(yīng)的過程稱為原位 PCR。 原位 PCR與普通 PCR的 主要區(qū)別 在于 模板的制備 。經(jīng)脫蠟處理的組織切片或滴加在載玻片上的細(xì)胞懸液都可作為擴(kuò)增樣品，所有步驟均 在載玻片上 進(jìn)行。 現(xiàn)在位置 P134 目 錄 （六）原位 PCR技術(shù)（ in situ PCR） 進(jìn)行 PCR時(shí)，加入地高辛標(biāo)記的的 dUTP，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有地高辛。 PCR結(jié)束，加入酶標(biāo)抗地高辛抗體，再加入底物顯色。 現(xiàn)在位置 P134 目 錄 （六）原位雜交 PCR ? 原位雜交 PCR與 原位 PCR的唯一區(qū)別： ? 擴(kuò)增結(jié)束后，用寡核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物作原位雜交。 現(xiàn)在位置 P134 目 錄 （七）差異顯示 PCR （ defferential display PCR,DDPCR） 現(xiàn)在位置 P182 一種以 逆轉(zhuǎn)錄 PCR為基礎(chǔ)的研究 基因表達(dá)差異 的技術(shù)。 DDPCR主要用于 腫瘤 和多種 疾病的分子遺傳學(xué)研究 ，是目前篩選基因表達(dá)差異最有效的方法。 目 錄 目 錄 （ X）免疫 PCR（ immunoPCR,IPCR） ?結(jié)合 PCR技術(shù)和抗原抗體反應(yīng) ?用于檢測抗原（蛋白質(zhì)） ?固相載體上包被有抗體 1 ?抗體 2上標(biāo)記有 DNA，作為 PCR的模板 現(xiàn)在位置 P134 目 錄 （ X）免疫 PCR（ ImmunoPCR,IPCR） ?第一步： ? 載體－抗體 1抗原 抗體 2－ DNA（ C－ DNA） ?第二步： ? C－ DNAPCR 現(xiàn)在位置 P134 目 錄 目 錄 （ X）免疫 PCR（ immunoPCR,IPCR） ?IPCR的靈敏度是 ELISA的 10010000倍 現(xiàn)在位置 P134 目 錄 第三節(jié) PCR產(chǎn)物的檢測 Detection of the PCR product 目 錄 第三節(jié) PCR產(chǎn)物的檢測
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