【文章內(nèi)容簡介】 其它各種tag。例子？ 生物素親和素系統(tǒng)（biotinavidin system，BAS）是以生物素和親和素具有的獨特結合特性為基礎，結合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，它們的結合迅速、專一、穩(wěn)定，并具有多級放大效應。 自20世紀70年代，BAS開始應用于免疫化學領域以來，利用BAS可被熒光索、酶、放射性核素等材料標記的特點而發(fā)展和建立了許多新的檢測方法和技術，尤其是與免疫標記技術的有機結合，極大地提高了測定的靈敏度。直接利用蛋白質(zhì)的相互作用：1） 蛋白質(zhì)親和層析：用蛋白質(zhì)當親和層析的親和基團。要有大量的蛋白質(zhì)2） 酵母雙雜交：優(yōu)點是簡單；缺點是不能得到修飾調(diào)控型的相互作用蛋白質(zhì)。還有衍生的酵母三雜交以及單雜交。3） 噬菌體展示：Physically固定蛋白質(zhì)，結合phage，洗脫，擴增phage，再結合；循環(huán)4） 快成化石的Bait蛋白質(zhì)篩表達庫：bait蛋白質(zhì)用同位素、GST、等標記，再篩庫。5） 一網(wǎng)打盡的 蛋白質(zhì)組：這是檢測和鑒定蛋白質(zhì)的方法。由于檢測和鑒定方法上的提高，使得許多蛋白質(zhì)間的相互作用都可以被用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和新的相互作用。缺點是發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白質(zhì)太多常常超出人們的辨別能力和研究能力。技術成果的鑒定：蛋白質(zhì)相互作用的生物學功能是蛋白質(zhì)相互作用的意義1） 相互作用的證實：不同的發(fā)現(xiàn)互相作用的技術都可以用來被驗證相互作用的蛋白質(zhì)。如GST pull down 發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，用免疫共沉淀或酵母雙雜交驗證。越接近生理狀態(tài)的證實越好。驗證方法和發(fā)現(xiàn)方法的差別越大驗證結果也越可靠。采用的方法多，結果也越可靠。2） 相互作用的生物學功能：有重要生物學功能的相互作用、一般功能的相互作用、還是沒有功能的相互作用。有運氣的成分。如果從重要功能蛋白質(zhì)出發(fā)，從重要生物學現(xiàn)象出發(fā)，“運氣”會越好。生物學功能的研究：技術成果的大小相互作用的生物學功能研究基本上可以歸為兩類：獲得功能或失去功能。獲得功能：轉基因表達，使得原本不表達該蛋白質(zhì)的細胞表達了蛋白質(zhì)，從而和已有的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，細胞有新的功能。常用的方法有細胞內(nèi)轉基因過表達蛋白質(zhì)、轉基因老鼠。失去功能：抑制蛋白質(zhì)的表達或用dominant negative突變體，使原有的蛋白質(zhì)缺失或失活，細胞功能的喪失。常用的方法有：RNA干擾使蛋白質(zhì)不表達、蛋白質(zhì)部分功能片斷的影響、基因敲除的細胞、基因敲除的老鼠。 一些常用蛋白質(zhì)相互作用技術：蛋白質(zhì)相互作用的親和力是技術的基礎。Kd=[A][B]/[AB]。Kd越小，親和力越好?？贵w的親和力為108 1010 M是好,106M是弱。 蛋白質(zhì)相互作用的目的是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用：生化方法（copurification提純，親和色譜法，GST pull down ,IP，WB, FarWestern）Surface plasmon resonance表面等離子體諧振、遺傳分析、酵母雙雜交、Fluorescence resonance energy transfer：FRET熒光共振能量轉移、 注釋：表面等離子體諧振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 生化分析儀，是基于物理光學現(xiàn)象和生物傳感技術的新型生化分析系統(tǒng)。熒光共振能量轉移（FPET）：當生色團被光照時，被照射激發(fā)的分子可以通過散發(fā)能量來返回到基態(tài)13。光能可被生色團在1015秒內(nèi)吸收而在109秒內(nèi)在發(fā)射出來。然而，也有可能被激發(fā)分子并不發(fā)光而將能量傳遞給別的生色團或是另外的熒光素，這些熒光素可以在相同的時間量級內(nèi)發(fā)熒光，這后一種現(xiàn)象稱為FPET.應用：是比較分子間距離與分子直徑的有效工具，廣泛用于研究各種涉及分子間距離變化的生物現(xiàn)象，可以定量測量兩個發(fā)光基團之間的距離，在蛋白質(zhì)空間構象、蛋白與蛋白間相互作用、核酸與蛋白間相互作用得到廣泛應用。 生化方法的具體實驗：1） GST pull down ,見ppt252） IP和CoIP：上網(wǎng)查3） FarWestern: ，而是用另一個蛋白質(zhì)通過相互作用與膜上蛋白質(zhì)作用。 blot。，F(xiàn)arWestern常常會包含一步蛋白質(zhì)復性的過程。4） SPR：用來監(jiān)控生物特定表面在金屬層的相互作用，通過測量這個相互作用引起的溶液濃度的變化。具體過程？BLAcore SPR的優(yōu)點：不用標記；實時測量 遺傳方法： 例子：有A：小量表達；有B：無表達；有C：無表達 有A和B：表達增加； 有A和C：小量表達；有B和C：無表達 有 A、B、C：高表達結論： 在A、B和C的蛋白質(zhì)復合體中，A是和基因調(diào)控區(qū)結合并有小的轉錄活性；B可以和A結合促進A的轉錄活性；C本身不能直接促進A的活性，所以不大可能和A有直接相互作用，但能通過B的介導進一步促進轉錄。 研究實例討論： G2/M期阻斷的實驗測定方法：根據(jù)DNA的含量變化 親和層吸：對磷酸化蛋白質(zhì)有特異性的結合（PY蛋白） 質(zhì)譜鑒定蛋白 磷酸化蛋白質(zhì)的驗證 蛋白質(zhì)生物學功能的驗證：Loss of function and gain of function 進一步尋找相互作用蛋白質(zhì) 細胞內(nèi)的定位和細胞器，與細胞器的動態(tài)相互作用 根據(jù)已知的蛋白質(zhì)結構和功能的特點，提出功能模型 模型的驗證 得到研究結論1．2． 生化方法（Biochemical approaches） 共純化、共沉淀Traditional copurification (chromatography copurification and cosedimentation) 在不同基質(zhì)上進行色譜層析 蛋白質(zhì)親和層析（Affinity chromatography）將一種蛋白質(zhì)固定于某種基質(zhì)上（如Sepharose），當細胞抽提液經(jīng)過改基質(zhì)時，可與改固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來。 GST pull down：為了更有效的利用蛋白質(zhì)親和色譜，可以將待純話的蛋白以融合蛋白的形式表達，即將”誘餌“蛋白與一種易于純化的配體蛋白融合。例如與GST融合的蛋白再經(jīng)過GSH的色譜柱時，就可以通過GST和GSH的相互作用而被吸附。當載有細胞抽提物經(jīng)過柱時，就可以得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的目標蛋白了。