真核細胞表達系統(tǒng)的類型與常用真核細胞表達載體(編輯修改稿)
2025-09-01 10:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 號等。將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎饕ㄟ^2類方法 ：一是感染性病毒顆粒感染宿主細胞，二是通過脂質(zhì)體法、顯微注射法 、磷酸鈣共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因?qū)氲郊毎小Ｍ庠椿虻捏w外表達一般采用質(zhì)粒表達載體，如將重組質(zhì)粒導(dǎo)入CHO細胞可建立高效穩(wěn)定的表達系統(tǒng)，而利用COS細胞可建立瞬時表達系統(tǒng)。目前，病毒載體已成為動物體內(nèi)表達外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發(fā)揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當(dāng)大(約187kb)，利用它作為載體可同時插入幾種外源基因，從 而構(gòu) 建多價疫苗。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染效率高，某些難轉(zhuǎn)染的細胞系也可通過其導(dǎo)入外源基因，但要注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒可整合入宿主細胞染色體，具有潛在的危險性。由于腺病毒易于培養(yǎng)、純化，宿主范圍廣，故采用該類病毒構(gòu)建的載體被廣泛應(yīng)用腺病毒載體的構(gòu)建依賴于腺病毒穿梭質(zhì)粒和包裝載體之間的同源重組。但是哺乳動物細胞內(nèi)的這種同源重組效率很低，利用細菌內(nèi)同源重組法構(gòu)建重組體效率會大大提高，即將外源基因插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，形成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將其線性化后與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。另一種方法是通過CrelaxP系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒載體，在轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒中都插入laxP位點，然后將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達Cre重組酶的哺乳動物細胞，通過Cre介導(dǎo)兩個laxP位點之間的DNA發(fā)生重組，可獲得重組腺病毒，這種重組效率比一般的細胞內(nèi)同源效率高30倍。最近，人們在桿狀病毒中插入巨細胞病毒的啟動子建立了高效的基因轉(zhuǎn)移載體。由于桿狀病毒是昆蟲病毒，在哺乳動物細胞中不會引起病毒基因的表達，而且載體的構(gòu)建容易，因而利用桿狀病毒進行基因轉(zhuǎn)移為我們提供了很好的途徑。利用哺乳動物細胞表達外源基因時，大多數(shù)情況下不需要誘導(dǎo)，但當(dāng)表達產(chǎn)物對細胞有毒性時應(yīng)采取誘導(dǎo)，這樣可避免表達產(chǎn)物產(chǎn)生早期就對細胞產(chǎn)生影響。哺乳動物細胞中用到的誘導(dǎo)型載體主要與啟動子有關(guān)如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導(dǎo)，還有重金屬、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動子。但這些系統(tǒng)存在一些共同的缺陷，如誘導(dǎo)表達特異性差。當(dāng)系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時表達有泄漏誘導(dǎo)劑本身有毒性，常對細胞造成損傷等。為此，Gossen等構(gòu)建了受四環(huán)素負調(diào)節(jié)的Teton基因表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)由調(diào)節(jié)質(zhì)粒和反應(yīng)質(zhì)粒組成。調(diào)節(jié)質(zhì)粒中具有編碼轉(zhuǎn)錄激活因子(fIA)的序列，在沒有四環(huán)素或強力毒素存在的情況下 tTA可引起下游目的基因表達。隨后Gossen等又對tTA的氨基酸序列進行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素正調(diào)節(jié)的Teton基因表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒有四環(huán)素的情況下啟動子不被激活，而在加入四環(huán)素或強力毒素后目的基因高效表達。四環(huán)素誘導(dǎo)的基因表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動物細胞誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有嚴密、高效可控制性強的優(yōu)點。外源蛋白的表達會對哺乳動物細胞產(chǎn)生不利影響，因此利用哺乳動物細胞表達外源基因時，一個主要問題便是外源基因不能持久穩(wěn)定地表達。Mielke等構(gòu)建了一種能夠在哺乳動物中穩(wěn)定表達異二聚體蛋白的載體系統(tǒng)，在這個系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和輕鏈的cDNA及嘌呤霉素抗性基因被轉(zhuǎn)錄成三順反子mRNA。內(nèi)部的順反子通過內(nèi)核糖體進入位點(IREs)介導(dǎo)進行翻譯，通過持續(xù)選擇壓力，無需繁瑣的篩選過程，便可獲得持久、穩(wěn)定表達抗體分子的重組體。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)常用的宿主細胞有CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主細胞對蛋白表達水平和蛋白質(zhì)的糖基化有不同的影響，因此在選擇宿主細胞時應(yīng)根據(jù)具體情況而定。利用基因工程技術(shù)表達外源蛋白。其產(chǎn)量還不高，難以滿足大規(guī)模的實際應(yīng)用。通過轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)可從動物的乳汁或植物的葉組織中很方便地獲得大量較純的生物活性物質(zhì)，但目前這項技術(shù)還不很成熟，有待進一步研究。目前已經(jīng)建立了多種誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，
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