【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ，目前國(guó)內(nèi)已有注射用重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素α2b、凍干鼠表皮生長(zhǎng)因子、外用凍干重組人表皮生長(zhǎng)因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素注射用重組人生長(zhǎng)激素、注射用A群鏈球菌、注射用重組人干擾素α2b、凍干人凝血因子VⅢ、凍干人纖維蛋白原、間苯三酚口服凍干片等凍干藥品獲準(zhǔn)上市。截止2000年2月，美國(guó)FDA已批準(zhǔn)的生物技術(shù)藥共計(jì)76個(gè)。2 藥品凍干損傷和保護(hù)機(jī)理　　藥品冷凍干燥是一個(gè)多步驟過(guò)程，會(huì)產(chǎn)生多種應(yīng)力使藥品變性，如低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力和干燥應(yīng)力。其中凍結(jié)應(yīng)力又可分為枝狀冰晶的形成，離子濃度的增加，PH值的改變和相分離等情況?！　∫虼?，為了保護(hù)藥品的活性，通常在藥品配方中添加活性物質(zhì)的保護(hù)劑。它需要具備四個(gè)特性：玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高、吸水性差、結(jié)晶率低和不含還原基。　　常用的保護(hù)劑有如下幾類(lèi)物質(zhì)：　　a) 糖類(lèi)/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麥芽糖等；　　b) 聚合物：HES、PVP、PEG、葡聚糖、白蛋白等；　　c) 無(wú)水溶劑：乙烯乙二醇、甘油、DMSO、DMF等；　　d) 表面活性劑：Tween 80等；　　e) 氨基酸：L絲氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、肌氨酸等；　　f) 鹽和胺：磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽等；　　由于冷凍干燥過(guò)程存在多種應(yīng)力損傷，因此保護(hù)劑保護(hù)藥品活性的機(jī)理也是不同的，可以分為低溫保護(hù)和凍干保護(hù)。 對(duì)于低溫保護(hù)，目前被廣為接受的液體狀態(tài)下蛋白質(zhì)穩(wěn)定的機(jī)理之一是優(yōu)先作用原理。優(yōu)先作用是指蛋白質(zhì)優(yōu)先與水或水溶液中的保護(hù)劑作用。在有起穩(wěn)定作用的保護(hù)劑存在的條件下，蛋白質(zhì)優(yōu)先與水作用（優(yōu)先水合），而保護(hù)劑優(yōu)先被排斥在蛋白質(zhì)區(qū)域外（優(yōu)先排斥）。在這種情況下，蛋白質(zhì)表面就比其內(nèi)部有較多的水分子和較少的保護(hù)劑分子。優(yōu)先作用原理同樣適用于冷凍融解過(guò)程。蛋白質(zhì)保護(hù)劑，在溶液中被從蛋白質(zhì)表面排斥，在凍結(jié)過(guò)程中能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)。但是優(yōu)先作用機(jī)理不能完全解釋用聚合物或蛋白質(zhì)自身在高濃度時(shí)保護(hù)蛋白質(zhì)的現(xiàn)象?！　≡趦龈蛇^(guò)程中，由于蛋白質(zhì)的水合層被除去，優(yōu)先作用機(jī)理不再適用。對(duì)于凍干保護(hù)機(jī)理，仍在研究探討之中，目前主要有兩種：　　a) 水替代假說(shuō)。許多研究者認(rèn)為由于蛋白質(zhì)分子中存在大量氫鍵，結(jié)合水通過(guò)氫鍵與蛋白質(zhì)分子聯(lián)結(jié)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在冷凍干燥過(guò)程中失去水分后，保護(hù)劑的羥基能替代蛋白質(zhì)表面的水的羥基，使蛋白質(zhì)表面形成一層假定的水化膜，這樣可保護(hù)氫鍵的聯(lián)結(jié)位置不直接暴露在周?chē)h(huán)境中，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因凍干而變性，使其即使在低溫冷凍和干燥失水的情況下，仍保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的完整性?！　) 玻璃態(tài)假說(shuō)。研究者認(rèn)為在含保護(hù)劑溶液的干燥過(guò)程中，當(dāng)濃度足夠大且保護(hù)劑的結(jié)晶不會(huì)發(fā)生時(shí)，保護(hù)劑水混合物就會(huì)玻璃化。研究發(fā)現(xiàn)在玻璃態(tài)下，物質(zhì)兼有固體和流體的行為，粘度極高，不容易形成結(jié)晶，且分子擴(kuò)散系數(shù)很低，因而具有粘性的保護(hù)劑包圍在蛋白質(zhì)分子的周?chē)?，形成一種在結(jié)構(gòu)上與玻璃狀的冰相似的碳水化合物玻璃體，使大分子物質(zhì)的鏈段運(yùn)動(dòng)受阻，阻止蛋白質(zhì)的伸展和沉淀，維持蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而起到保護(hù)作用。　　目前大部分學(xué)者贊同水替代假說(shuō)，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到蛋白質(zhì)和保護(hù)劑之間的氫鍵，為理論提供證據(jù)。事實(shí)上，無(wú)論是水替代假說(shuō)還是玻璃態(tài)假說(shuō)，它們的基礎(chǔ)都是基于藥液實(shí)現(xiàn)了部分或全部玻璃化凍結(jié)。4 凍干工藝及優(yōu)化　　由于藥品冷凍干燥過(guò)程會(huì)產(chǎn)生多種應(yīng)力，對(duì)凍干藥品的藥性有很大的影響，因此對(duì)藥品冷凍干燥過(guò)程進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，對(duì)于減少凍干損傷和提高凍干藥品的質(zhì)量有重大的意義。 　　冷凍干燥過(guò)程中的凍結(jié)過(guò)程非常重要，因?yàn)樵趦鼋Y(jié)中形成的冰晶形態(tài)和大小以及玻璃化程度不僅影響后繼的干燥速率，而且影響凍干藥品的質(zhì)量。因此在凍結(jié)過(guò)程中必須考慮配方、凍結(jié)速率、凍結(jié)方式、以及是否退火等問(wèn)題。 配方的影響　　配方中的固體含量會(huì)影響凍結(jié)和干燥過(guò)程。如果固體含量少于2%，那么凍干藥品結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能就會(huì)不穩(wěn)定。尤其在干燥過(guò)程中，藥品微粒不能粘在基質(zhì)上，逸出的水蒸氣會(huì)把這些微粒帶到小瓶的塞子上，有時(shí)甚至?xí)У秸婵帐耶?dāng)中?！　〈送?，為了獲得均勻一致、表面光滑、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)藥品，配方中必須含有填充劑、賦形劑、穩(wěn)定劑等保護(hù)劑，這些保護(hù)劑對(duì)實(shí)現(xiàn)藥品的玻璃化凍結(jié)有重大的影響。很多糖類(lèi)或多元醇經(jīng)常被用于溶液凍融和凍干過(guò)程中非特定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑，它們既是有效的低溫保護(hù)劑又是很好的凍干保護(hù)劑，它們對(duì)凍結(jié)的影響取決于種類(lèi)和濃度。文獻(xiàn)對(duì)不同的保護(hù)劑進(jìn)行了詳盡的研究，探討了它們的凍結(jié)特性。文獻(xiàn)還研究了其它保護(hù)劑的凍結(jié)特性。但是蛋白質(zhì)種類(lèi)很多，而且物理化學(xué)性質(zhì)各異，因此不同的蛋白質(zhì)需要不同的保護(hù)劑配方，因此它們的凍結(jié)特性就不同，一般需要實(shí)驗(yàn)。 凍結(jié)方式　　凍結(jié)方式不同，產(chǎn)生的冰晶的形態(tài)和大小就不同，而且會(huì)影響后繼的干燥速率和凍干藥品質(zhì)量。根據(jù)凍結(jié)機(jī)理，可以把凍結(jié)分為全域過(guò)冷結(jié)晶和定向結(jié)晶兩類(lèi)?！　∪蜻^(guò)冷結(jié)晶是指全部藥液處于相同或相近的過(guò)冷度下進(jìn)行凍結(jié)的方式。在全域過(guò)冷結(jié)晶中，凍結(jié)速率和冰晶成核溫度是重要的參數(shù)。　　全域過(guò)冷結(jié)晶按凍結(jié)速率的快慢可分為慢速凍結(jié)和快速凍結(jié)。快速凍結(jié)的冰晶細(xì)小，而且沒(méi)有凍結(jié)濃縮現(xiàn)象，但是存在不完全凍結(jié)現(xiàn)象。相反，慢速冷卻產(chǎn)生較大的冰晶，并且存在凍結(jié)濃縮的現(xiàn)象。Thomas W Patapoff等人發(fā)現(xiàn)如果把藥品直接浸入液氮或干冰乙醇溶液槽中（快速凍結(jié)），那么晶核首先在瓶壁產(chǎn)生，然后冰晶向中心擴(kuò)散，再垂直向上擴(kuò)散。由于長(zhǎng)成的冰晶細(xì)小，而且有水平方向的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致干燥階段的傳質(zhì)阻力很大，升華速率降低。實(shí)驗(yàn)證明，快速凍結(jié)導(dǎo)致升華速率低，解吸速率快，慢速凍結(jié)導(dǎo)致升華速率快，解吸速率慢?！　ames A Searles等人認(rèn)為冰晶成核溫度是全域過(guò)冷結(jié)晶的重要因素，因?yàn)樗巧A速率的主要決定因素。他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，冰晶成核溫度從本質(zhì)上來(lái)說(shuō)是隨機(jī)的、不穩(wěn)定的，不容易控制，但是受溶液中的微粒含量和是否存在冰晶成核體等影響因素。正是冰晶成核溫度的隨機(jī)性導(dǎo)致升華干燥速率的不均勻性以及與形態(tài)相關(guān)的參數(shù)，如凍干藥品表面積和解吸干燥速率?！　《ㄏ蚪Y(jié)晶是指一小部分藥液處于過(guò)冷狀態(tài)下進(jìn)行凍結(jié)的方式。Thomas W Patapoff介紹了一種垂直凍結(jié)方式。溶液用濕冰冷卻，在瓶子底部用干冰冷卻，形成晶核，然后放到50℃的擱板上凍結(jié)。用這種方式凍結(jié)的樣品的冰晶在垂直方向呈現(xiàn)煙囪狀，在藥品表面沒(méi)有凍結(jié)濃縮層，而且整個(gè)藥品的結(jié)構(gòu)均一性很好，因此在干燥時(shí)的傳質(zhì)阻力很小，加快了凍干速率。Martin Kramer等人采用了另外一種方式實(shí)現(xiàn)了定向凍結(jié)。，擱板溫度為+10℃的條件下，讓溶液開(kāi)始表面凍結(jié)，形成1～3mm左右的冰晶薄層。然后解除真空，降低擱板溫度到結(jié)晶溫度以下進(jìn)行凍結(jié)。在這種條件下長(zhǎng)成的冰晶粗大，也呈煙囪狀。同時(shí)在干燥階段發(fā)現(xiàn)，升華干燥時(shí)間比采用一般凍結(jié)的時(shí)間節(jié)省了20%。分析凍干藥品時(shí)還發(fā)現(xiàn)，對(duì)甘露醇，采用這種方式凍結(jié)的凍干品的剩余含水量比采用一般凍結(jié)的要多；但對(duì)蔗糖和甘氨酸，兩者差別不大。H Schoof等人在凍干膠原質(zhì)時(shí)也采用了定向結(jié)晶的方式?！　鼋Y(jié)方式不同，產(chǎn)生的冰晶形態(tài)和大小就不同，后繼的干燥速率也不同。實(shí)驗(yàn)證明，采用定向結(jié)晶方式的凍結(jié)藥品的干燥速率比全域過(guò)冷結(jié)晶的快。但是無(wú)論采用哪種凍結(jié)方式，藥品溶液必須部分或全部實(shí)現(xiàn)玻璃化凍結(jié)，以保護(hù)藥品藥性。 退火　　退火是指把凍結(jié)藥品溫度升到共熔溫度以下，保溫一段時(shí)間，然后再降低溫度到凍結(jié)溫度的過(guò)程。在升華干燥之前增加退火步驟，至少有三個(gè)原因：　　a) 強(qiáng)化結(jié)晶。在凍結(jié)過(guò)程特別是快速凍結(jié)過(guò)程中，配方中結(jié)晶成分往往來(lái)不及完全結(jié)晶。但是如果該成分能為凍干藥品結(jié)構(gòu)提供必要的支撐或者蛋白質(zhì)在該成分完全結(jié)晶后會(huì)更穩(wěn)定，那么就有必要完全結(jié)晶。此外，凍結(jié)濃縮液中也會(huì)有一部分水來(lái)不及析出，使其達(dá)不到最大濃縮狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)退火的溫度高于配方的最大濃縮液玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg39。時(shí)，會(huì)促進(jìn)再結(jié)晶的形成使結(jié)晶成分和未凍結(jié)水結(jié)晶完全。　　b) 提高非晶相的最大濃縮液玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg39。從非晶相中除去Tg39。較低的結(jié)晶成分，能夠提高非晶相的Tg39。Barry J Aldous在研究非晶態(tài)碳水化合物的水合物結(jié)晶規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)退火之后的海藻糖干燥溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度由31℃上升到79℃，大大提高了穩(wěn)定作用?！　) 改變冰晶形態(tài)和大小分布，提高干燥效率。James