生物化學技術6--凝膠過濾(編輯修改稿)
2025-08-31 17:34 本頁面
【文章內容簡介】 ， Ve=Vo+Vi 。 即小分子可完全滲入凝膠內部時 ， 洗脫體積應為空隙體積與內水體積之和 。 Ve=Vo+Vi （ 圖中組分 Ⅲ ） 當 0＜ Kav＜ 1時 ， Ve=Vo+ Kav（ Vi ＋ Vg ） 。 表示固定相中只有一部分可被組分擴散滲入 ， 一部分被排阻 ， Ve即在Vo與 Vo+Vi＋ Vg之間變化 （ 圖中組分 Ⅱ ） 有時 Kav＞ 1， 表示凝膠對組分有吸附作用 （ 從內水中洗脫出來的含量下降），此時 Ve＞ Vo+Vi＋ Vg。 例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在 Sephadex G25中的洗脫體積遠超出理論計算的最大值 二、 值的測定 avkotoeav VVVVk???只要測出 、 和 ，即可計算出 值 eVoVtV avktV1. 的測定： （ 1）計算法： （ 2）測定法： hRV t ??? 2?itiggitVVVVVVVVV?????00相比可忽略，故與由于? 的測定： 用藍色的葡聚糖 2022（ M=200萬），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身的顏色，采用肉眼或分光光度計檢測（ 2 260或 620nm）洗脫體積 ? 的測定： 用 、 N乙酰酪氨酸或其他小分子物質作為洗脫對象。由于分子量小，且無吸附，故洗脫體積剛好是 （ =1） ? 當分子大小在凝膠孔徑的上、下限之間時，則 介于 和 之間（即 =0 ~ 1） oVoV424 )( SONHtVtVavkeV oVtV avk第三節(jié) 操 作 （ 一 ） 凝膠的選擇 ： 凝膠型號不一樣 ， 篩分范圍亦不相同 如： Sephadex G 型多用于分離蛋白質； 生物膠和 Sephacryl等多用于分離核酸； 要除去蛋白質中的鹽類 ， 多用 Sephadex G25 ： 粒度與交聯(lián)度無關 。 與粗顆粒相比 ， 細顆粒凝膠之間空間小 ， 裝柱易均勻 ， 分離效果好 ， 但流速慢；而粗顆粒凝膠流速快 ， 宜用小顆粒直徑的層析柱 一、凝膠的選擇與處理 （二）凝膠用量計算 膨脹度）干凝膠用量（hrg ??? 2? 由于凝膠在處理過程中會有一部分損失，故用此法計算出的凝膠用量需增加 10~20% （三）凝膠的處理 將所用的干膠置于 5~10倍量的 ，充分浸泡（表 62溶脹時間），用傾斜法去除表面懸浮的小顆粒，再用，抽濾除去堿液，用 。再用抽氣方法以 粒之間的氣泡 1． 柱子的選擇 ① 當直徑相同時 ， 柱長長者比柱長短者分辨率高 ② 柱長相同時 ， 直徑大者比小者分辨率高 ③ 床體積相同時 ， 柱長長者比短的分辨率高 一般理想的層析柱直徑與長度之比是 1： 25~1： 100；層析柱外面最好有夾套 ， 能控制溫度 （ 柱溫箱 ） ， 以保證結果的重復性 2． 裝柱： 常用濕裝法 （ 第三章 ） 3． 凝膠柱的鑒定 二、凝膠柱的制備 流速、柱長對分離的影響 加樣量與層析柱床體積及檢測方法的靈敏度有關 。 床體積越小 、 方法靈敏度越高時 ， 加樣量越少 層析的目的在于分析時 ， 加樣量占床體積的 1～ 2％ ， 作制備 、 脫鹽用時 ， 占 20～ 30％ 一般來說 ， 加樣量越少 ， 分辨率越高 。 具體加樣體積由分配系數(shù) (Kav)或洗脫體積 (Ve)來決定 三、加樣與洗脫 （一）加 樣 VeA、 VeB： 組分 A、 B的洗脫體
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