【文章內(nèi)容簡介】 脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)外 ， 所有 α －氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮產(chǎn)生蘭紫色物質(zhì) 。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 六、注意事項(xiàng) 1． 切勿用手直接接觸濾紙和顯色劑 。 2. 點(diǎn)樣過程中必須在第一滴樣品干后再點(diǎn)第二滴 。 3．使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。 七、思考題： ? 1．做好本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是什么？ ? 2．實(shí)驗(yàn)操作過程，為何不能用手接觸濾紙？ ? 3．影響 Rf值的因素有哪些？ 實(shí)驗(yàn)二 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳 ? 實(shí)驗(yàn)原理 ? 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 ? 實(shí)驗(yàn)試劑 ? 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)原理 醋酸纖維薄膜電泳 (CAME)是以醋酸纖維薄膜 (CAM)作支持物的一種 區(qū)帶電泳技術(shù)。醋酸纖維素薄膜是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸 酯。將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮，氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂 抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，滲 透性強(qiáng)，對分子移動(dòng)阻力小，厚度為 120μm 。 本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素薄膜為電泳支持物，分離人血清蛋白。血清蛋白中含有清蛋白、 α1球蛋白、 α2球蛋白、 β－球蛋白、 γ－球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場中的遷移速度不同。分子量小、等電點(diǎn)低的，在相同堿性 PH緩沖體系中，帶負(fù)電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場中遷移速度快。例如人血清蛋白在 ，染色后可顯示 5條區(qū)帶。清蛋白泳動(dòng)最快，其 余依次是球蛋白 。 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 （一）、材料：人血清 （二）、儀器 醋酸纖維薄膜 (8X2mm)；點(diǎn)樣器；染色皿，漂洗器， 鑷子；玻璃板；常壓電泳儀；直流電源整流器；水平電泳 槽；粗濾紙；直尺和鉛筆 實(shí)驗(yàn)試劑 巴比妥緩沖液 ( I=)；氨基黑 10B染色液；漂洗液；95％乙醇 45ml、冰醋酸 5ml；蒸餾水 50ml；洗脫液 ／LNaOH；透明液；無水乙醇；冰醋酸＝ 7： 3 實(shí)驗(yàn)步驟 1． 浸泡：用鑷子取醋酸纖維薄膜放在緩沖液中浸泡 20分 鐘。 2． 點(diǎn)樣：把膜條從緩沖液中取出，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干 多余的液體，然后鋪在玻璃板上 (無光澤面朝 上 )，將點(diǎn)樣器在血清中沾一下（量薄薄一層為 好），再在膜條一端 23厘米處輕輕水平地落下 并隨時(shí)提起，這樣即在膜條上點(diǎn)上了細(xì)條狀的血 清樣品。 3．電泳：在電泳槽內(nèi)加入緩沖液，使兩個(gè)電極槽內(nèi)的液面 等高，將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上 。 膜 條點(diǎn)樣的一端放在負(fù)極上。通電，電流強(qiáng)度每條 膜 1mA(注意強(qiáng)度 ),電泳時(shí)間約為 50分鐘。 4．染色：電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡 5分 鐘。 5．漂洗：將膜條從染色液中取出后移置到漂洗液申漂洗數(shù) 次至無蛋白區(qū)底色脫凈為止，可得到色帶清晰的 電泳圖譜。 6．透明：將脫色后干燥的電泳圖譜膜條放入透明液中浸泡 2～ 3分鐘后取出平鋪在玻璃板上 ,用一直徑 的玻璃棒將其間的氣泡趕出 ,兩者之間不能有泡。 干燥后此透明薄膜 ,區(qū)帶著色清晰 ,可用于光吸收掃 描 ,長期保存不褪色。 思考題： ? １ .為什么將薄膜的點(diǎn)樣端放在濾紙橋的負(fù)極端？ ? ２ .用乙酸纖維素薄膜作為電泳支持物有何優(yōu)點(diǎn)？ 實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn) —— 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? （ 1）了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。 ? （ 2）學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 雙縮脲反應(yīng) ? 尿素加熱至 180℃ 左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與 Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)。可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定。 ? 雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)所有。含有一個(gè)肽鍵和一個(gè) — CS— NH2， — CH2— NH2， — CRH—NH2， — CH2— NH2— CHNH2— CH2OH或 — CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)也有此反應(yīng)。 NH3干擾此反應(yīng)，因?yàn)?NH3與 Cu2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子 Cu（ NH3） 42+。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。 茚三酮反應(yīng) ? 除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有 α— 氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏， 1∶ 1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測定方法。 ? 茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成 CONH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。 ? 此反應(yīng)的適宜 pH為 5~7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同 pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色。 黃色反應(yīng) ? 含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。 ? 多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。 乙醛酸反應(yīng) ? 在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì)，反應(yīng)機(jī)理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。 三、儀器、材料和試劑 實(shí)驗(yàn)儀器 試管；試管架；漏斗；鐵架臺；滴管；試劑瓶；水浴鍋。 實(shí)驗(yàn)材料和試劑 尿素； 10%氫氧化鈉溶液； 1%硫酸銅溶液； 2%卵清蛋白溶液； %甘氨酸溶液；%茚三酮水溶液；大豆提取液；頭發(fā)；指甲； %苯酚溶液；濃硝酸； %色氨酸溶液； %酪氨酸溶液；冰醋酸 、 濃硫酸 。 四、操作步驟與方法 取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加 10%氫氧化鈉溶液約 1ml，振蕩混勻，再加 1%硫酸銅溶液 1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約 1ml和 10%氫氧化鈉溶液 2ml，搖勻，再加 1%硫酸銅溶液 2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。 雙縮脲反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作 茚三酮反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作 ? ① 取 2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液 1ml，再各加 %茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱 1~2分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。 ? ②在一小塊濾紙上滴一滴 %甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴一滴 %茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。 黃色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作 ? 向 7個(gè)試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10%氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。 管 號 1 2 3 4 5 6 7 材 料 （滴） 雞蛋清 溶液 4 大豆 提取液 4 指甲 少許 頭發(fā) 少許 % 苯酚 4 % 色氨酸 4 % 酪氨酸 4 濃硝酸 /（滴） 2 4 40 40 4 4 4 現(xiàn)象 乙醛酸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作 ? 取 3支試管。編號。分別按上表加入蛋白質(zhì)溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸 2毫升，混勻后傾斜試管，沿管壁分別緩緩加入濃硫酸約 1毫升，靜置。觀察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。若不明顯，可于水浴中微熱。 試劑 管號 水 滴 %色氨酸溶液（滴） 蛋白質(zhì)溶液（滴） 冰醋酸 （ ml） 濃硫酸 （ ml） 現(xiàn) 象 1 5 2 1 2 4 1 2 1 3 5 2 1 五、思考題： ? ？并說明原因。 ? 物茚三酮反應(yīng)的結(jié)果嗎？試解釋之。 ? 在？ ? （蛋白質(zhì)中的、非蛋白質(zhì)中的）可以與濃硝酸作用呈現(xiàn)黃色反應(yīng)的陽性結(jié)果？ 實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)的變性、沉淀反應(yīng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? （ 1） 加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識 。 ? （ 2）了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。