基因工程：第六章(編輯修改稿)
2024-08-31 14:24 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 DHFR的活性 ） ， 選擇轉(zhuǎn)化子 。 這樣分離出來的抗性克隆 ， 顯然都是由于具有小鼠 DHFR基因的克隆片段 ， 賦予寄主細(xì)胞新的抗性表型所致 。 利用噬菌斑形態(tài)選擇重組體分子 把 DNA包裝成有活性的噬菌體顆粒 ， 主要取決于兩個(gè)因素：一是要具有能被 ?噬菌體包裝蛋白和頭部前體所識(shí)別的區(qū)域 ， 即 cos區(qū)；二是 DNA的長(zhǎng)度 ， 只有重組體 DNA是野生型 ? DNA的 75~105%的長(zhǎng)度時(shí) ， 才能在培養(yǎng)平板上形成清晰的噬菌斑 ， 而單一的載體 DNA是不會(huì)包裝成活的噬菌體顆粒的 。 經(jīng)體外包裝 ， 轉(zhuǎn)導(dǎo)后能否形成清晰噬菌斑 ，尤其是對(duì)替換型 ?載體 ， 本身就是一種可利用的選擇標(biāo)記 。 另外 cI基因插入失活后 ， 會(huì)誘發(fā)溶源性細(xì)菌的原噬菌體進(jìn)入溶菌周期 ， 根據(jù)產(chǎn)生噬菌斑的清晰與混濁 ， 也可以進(jìn)行選擇 。 利用核酸雜交篩選 從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆 ， 最廣泛使用的一種方法是核酸分子雜交技術(shù) 。 它所依據(jù)的原理是放射性同位素（ 32P或 125I） 標(biāo)記的 DNA或 RNA探針進(jìn)行DNADNA或 DNARNA雜交 ， 利用同源 DNA堿基配對(duì)的原則檢測(cè)特定的重組克隆 。 核酸雜交篩選法的最大優(yōu)點(diǎn)是它可以普遍廣泛地應(yīng)用 ， 尤其適合于大量群體的篩選 ， 只要有現(xiàn)成可用的特異性探針 ， 就可以有效地檢測(cè)任何一種插入的外源 DNA序列 ， 而不以這種序列能否在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)為前提 。 原位雜交篩選 生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑 ，按照其原來的位置不變地影印在硝酸纖維素濾膜上 ， 并在原位發(fā)生溶菌 、 DNA變性和雜交作用 ， 而將母板很好地保存起來 。 因?yàn)樽冃?DNA同硝酸纖維素濾膜有很強(qiáng)的親和力 ，便在膜上形成 DNA的印跡 ， 在 80℃ 下烘烤濾膜 ， 使 DNA牢固地固定下來 。 用放射性同位素標(biāo)記的 RNA或 DNA為探針同濾膜上的菌落所釋放的變性 DNA雜交 ， 并用放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè) ， 凡是含有與探針互補(bǔ)序列的菌落 DNA， 就會(huì)在 X光膠片上出現(xiàn)曝光點(diǎn) 。 根據(jù)曝光點(diǎn)的位置 ， 便可以從保留的母板上相應(yīng)位置挑出所需要的陽性菌落或噬菌斑 ，這就是所需要的含有目的基因插入片段的重組體克隆 。 核酸雜交檢測(cè)的探針 進(jìn)行核酸分子雜交的前提是要有特定的DNA或 RNA作探針 。 具有一定已知序列的核酸片段 ， 大小通常為 20kb左右 ， 再帶上一定的探測(cè)標(biāo)記 ， 就構(gòu)成了核酸探針 。 它可以通過分子雜交與待測(cè)基因的 DNA序列結(jié)合 ， 產(chǎn)生雜交信號(hào) ， 從而把待測(cè)基因的質(zhì)和量顯示出來 。 1. 放
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