課件病毒載體(編輯修改稿)
2025-08-28 17:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 能作為治療劑長期發(fā)揮作用 3. 缺失 E1B 基因產(chǎn)物導(dǎo)致有效地抗凋亡機(jī)制的喪失。在 E3產(chǎn)物缺失時(shí)產(chǎn)生與 E1B 基因產(chǎn)物類似的效果。 31 4. 可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的腺病毒 (replicationpetent adenovirus， RCA) 一個(gè)原因是細(xì)胞中存在 E1樣蛋白，可以模擬 E1蛋白的部分功能，激活 E2基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致有復(fù)制能力的腺病毒產(chǎn)生。 另一個(gè)原因是在很高的病毒滴度時(shí)， E2基因轉(zhuǎn)錄對(duì) E1基因的依賴性被削弱，導(dǎo)致 E2基因的轉(zhuǎn)錄，有復(fù)制能力的腺病毒產(chǎn)生。 32 第二代腺病毒載體 為了克服第一代載體的缺點(diǎn)，對(duì)腺病毒進(jìn)行進(jìn)一步的改造。將 E2基因和 /或 E4基因的部分或者全部去除，因此，病毒 DNA復(fù)制的能力消失，有復(fù)制能力的病毒產(chǎn)生機(jī)率降低。有復(fù)制能力的病毒的產(chǎn)生也可以通過構(gòu)建不含腺病毒載體重疊序列的細(xì)胞系做為病毒復(fù)制的輔助細(xì)胞的方式阻止其產(chǎn)生。 33 優(yōu)點(diǎn)與存在的問題 ? 外源基因的容量增加了： 14kb ? 外源基因的表達(dá)時(shí)間比第一代病毒載體有所延長，但仍然不能長期持續(xù)表達(dá)。 ? 宿主的免疫反應(yīng)仍然是影響外源基因持久表達(dá)的主要障礙，特別是在發(fā)生重復(fù)感染的時(shí)候這種作用尤其明顯。 34 第三代重組腺病毒載體 第三代腺病毒載體的構(gòu)建是將病毒的其他基因全部或接近全部刪除。這就是所謂的“空腸病毒”載體，它僅保留了ITR和包裝信號(hào)序列，因此需要輔助病毒和適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞用于病毒的繁殖，病毒的獲得需要仔細(xì)的純化。 35 ? 而且，這些新技術(shù)也帶來新的問題，主要是由輔助病毒污染及載體的不穩(wěn)定性所引起。 ? 構(gòu)建載體的一個(gè)因素是需要維持載體的正常大小才能完成有效地 DNA的包裝。這個(gè)問題可以通過“填充” DNA來完成，盡管這些填充 DNA片段的性能可以影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。 ? 已經(jīng)明確 E4基因的部分保留有利于宿主細(xì)胞戰(zhàn)勝T細(xì)胞免疫反應(yīng)從而有利于病毒生存，因此改造載體時(shí)可以保留部分 E4基因。 36 ? 為了解決輔助病毒造成的污染問題，最近的改造載體系統(tǒng)引入了 CreloxP 輔助依賴系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在特定時(shí)段將輔助病毒基因去除，從而避免包裝時(shí)產(chǎn)生輔助病毒的基因污染問題。 ? 輔助病毒污染問題解決了，但是也存在著一定的細(xì)胞毒性問題。 37 ? 為了解決病毒載體的細(xì)胞毒性問題引入了腺病毒載體的 ITR區(qū)與其他病毒相雜交的策略，從而有利于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。 ? 使用相似的策略，將鼠白血病病毒的長末端重復(fù)序列與腺病毒載體雜交，這一系統(tǒng)改造使得腺病毒載體能夠在體內(nèi)外持久的表達(dá)轉(zhuǎn)基因。這就形成了一套新的載體系統(tǒng)，嵌合載體。 ? 來自其他種屬的腺病毒（禽類，羊，牛，犬類等）用于構(gòu)建基因治療的病毒載體，這些病毒通常不會(huì)引起局部體液免疫反應(yīng)。 38 靶向性腺病毒載體 ? 野生型的腺病毒 (Adwt)具有完整的 E1基因，可以啟動(dòng)早期蛋白的表達(dá)和腺病毒的復(fù)制。 ? 非復(fù)制性腺病毒 (Ad)將 E1A基因完全刪除，這樣病毒不能傳代，除非在包括表達(dá) E1A基因的包裝細(xì)胞的輔助下才能完成。 ? 載體中插入腫瘤特異性啟動(dòng)子后，該啟動(dòng)子使腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)功能，而在非腫瘤細(xì)胞中不存在此功能。 39 腫瘤靶向性腺病毒載體 40 41 確保載體有效表達(dá)的策略 將免疫反應(yīng)和凋亡反應(yīng)最小化。 ? 保留 E3基因盒子 或者給與抗 CD4試劑治療，能夠降低 T輔助細(xì)胞免疫反應(yīng)。 ? 刪除 E4基因盒子 可以降低 Th2和 B 細(xì)胞活性 ? CD8融合于 TNFa受體的胞外區(qū) 能夠降低體液免疫反應(yīng)。 ? TNF誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)可以被 E3基因產(chǎn)物阻斷。 42 影響轉(zhuǎn)基因傳遞的因素。 ? 細(xì)胞受體 CD3, 成纖維母細(xì)胞生長因子 , 肝素或者胃泌素等 ? 使用來自流感病毒的血凝素多肽 43 確保轉(zhuǎn)基因表達(dá)。 ? 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件。 44 腺病毒載體的臨床應(yīng)用 1. 用于腫瘤的基因治療：由于腺病毒載體可以實(shí)現(xiàn)治療基因的短暫高表達(dá)，因此在腫瘤基因治療中具有無可比擬的優(yōu)勢。 HSVtk自殺基因腺病毒載體用于頭頸部癌癥、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等的治療研究 用于轉(zhuǎn)移 IL GMCSF等細(xì)胞因子和 p53等抑癌基因，治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部腫瘤等研究。 2. 用于遺傳性疾病的基因治療：如用于糾正囊性纖維化中囊性纖維化跨膜通道調(diào)節(jié)因子（ CFTR）基因缺陷 45 3. 作為輔助性治療手段：如腺病毒載體將鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ OTC）基因轉(zhuǎn)移入高血氨癥患者的肝細(xì)胞，可以部分恢復(fù)該基因的功能，血中鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的濃度接近正常水平，使血氨水平降低。 4. 其他應(yīng)用：心血管疾病的基因治療，用于轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等。 46 47 48 49 腺相關(guān)病毒載體 腺相關(guān)病毒（ adenoassociated virus， AAV）屬于人類細(xì)小病毒屬，基因組為單鏈 DNA，復(fù)制缺陷型病毒 ，無致病原性 。 . 50 ? AAV復(fù)制周期由兩個(gè)明顯的階段構(gòu)成：潛伏期和增殖期。在輔助病毒諸如腺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒或者在基因毒存在的條件下 ,AAV能復(fù)制產(chǎn)生子代病毒顆粒。 ? 在缺少輔助病毒的情況下，腺相關(guān)病毒整合其基因組到 19號(hào)染色體的一個(gè)特別位點(diǎn)并保持整合狀態(tài)直到隨后的輔助病毒將其從潛伏狀態(tài)下拯救出來。 ? AAV的位點(diǎn)特異性的整合能力、其復(fù)制的自然缺陷以及其無致病原
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