人工染色體載體ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-29 00:10 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 連接成一個片段，會影響實驗結(jié)果的分析，后來專門選出 30～45kb的外源 DNA插入載體 DNA，此時， 每個載體只可能插入一個外源片段 ，因為如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度； 2022/5/25 30 ③細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則 篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費時間。 現(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定， 插入的大片段外源 DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。 2022/5/25 31 2022/5/25 32 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。 YAC具有 自主復制序列 、 克隆位點 以及可在細菌和酵母菌中 選擇的標記基因 。此外， YAC還具有酵母菌染色體的一些特點?？梢越邮?001000kb的外源 DNA片段。 第二節(jié) 酵母人工染色體載體 2022/5/25 33 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 這種人工染色體克隆載體實際上是一種 “穿梭” 克隆載體，含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的 第一受體 (大腸桿菌 )源 質(zhì)粒復制起始位點(ori)，還含有 第二受體 (如酵母菌 )染色體 DNA著絲點、端粒和復制起始位點 的序列，以及合適的 選擇標記 基因。 第二節(jié) 酵母人工染色體載體 2022/5/25 34 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 一、 YAC載體的復制元件和標志基因 YAC載體應含有下列元件： 酵母染色體的端粒序列 酵母染色體的復制子 酵母染色體的著絲粒序列 酵母系統(tǒng)的選擇標記 大腸桿菌的復制子標記 YAC載體的裝載量為 250 400 kb ?這樣的克隆載體在第一受體細胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復制形式進行高拷貝復制。 ?這種克隆載體在體外與目的 DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細胞，可在轉(zhuǎn)化的細胞內(nèi)按染色體 DNA復制的形式進行復制和傳遞。 篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標記； 篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補的營養(yǎng)缺陷型 。 人工染色體克隆載體的 特點 ： 能容納長達 1000 kb甚至 3000 kb的外源DNA片段。 人工 酵母 染色體克隆載體的構(gòu)建 YAC(酵母人工染色體 )克隆載體是最早構(gòu)建成功的人工染色體克隆載體。 將酵母染色體 DNA的端粒 (TEL)、 DNA復制起點 (ARS)和著絲粒 (CEN)以及必要的選擇標記(HISA4和 TRPl)基因序列克隆到大腸桿菌質(zhì)粒pBR322中，構(gòu)建成 YCA克隆載體。 2022/5/25 38 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 二、 YAC載體的工作原理 EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 此克隆載體的 sup4(抑制基因：抑制赭色表型 )基因上，組裝了供插入外源 DNA片段的克隆位。 常用的 YAC克隆載體有 3種： pYAC pYAC4和 pYAC5。 差別： 在 sup4基因上的克隆位點不同，分別是SnaBI、 EcoRI和 NotI。 （紅色，赤紅色） 2022/5/25 40 ? 主要結(jié)構(gòu)： ①兩個可在酵母菌中利用的選擇基因， URA3和 TRP1(色氨酸合成基因 )； ②酵母菌著絲粒序列 (centromere4,CEN4)；
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