【文章內容簡介】 操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底 物應用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中， OPD和 H2O2一般分成二組分， OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的 ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為 % H2O2的應用液 ,只需加入 OPD后即可作為底物應用液。 ? TMB經 HRP作用后產物顯藍色，目視對比鮮明。 TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與 H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外， TMB又有無致癌性等優(yōu)點，因此在 ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用 HCL或 H2SO4終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為 450nm。 ? AP的底物 AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯 (pnitrophenyl phosphate,pNPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產物為黃色的對硝基酚，在 405nm波長處有吸收峰。用 NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。 AP也有發(fā)熒光底物（磷酸 4甲基傘酮），可用于 ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 ? 返回 ? 、洗滌液 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫 20，其濃度可在 %%之間，高于 %時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。 返回 ? 常用的 HRP反應終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式 ELISA中一般采用 2mol/L。 ? 參考標準品 定量測定的 ELISA試劑盒應含有制作標準曲線用的參考標準品，應包括覆蓋可檢測范圍的 45個濃度，一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中。 ? 返回 ? ELISA實驗過程 ? 試劑的準備 按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。 ELISA實驗中應用蒸餾水或去離子水。自配的緩沖液的 PH應用 pH計進行較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。 ? 返回 ? 加樣 在 ELISA實驗中一般有 5次加樣步聚，即加標準品、加樣本、加酶標記物、加底物、加反應終止液。加樣時應將所加物加在 LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。 加樣時一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā) 生交叉污染。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。 ? 返回 ? 保溫 在 ELISA中一般加標本和加酶標記物后會有一次抗原抗體反應。抗原抗體反應的完 成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)。 ? ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么 ELISA反應總是需要一定時間的溫育。 溫育常采用的溫度有 43℃ 、 37℃ 、室溫和 4℃ （冰箱溫度）等。為了便于操作目前絕大部分的試劑盒均采用室溫進行溫育反應，操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內，標準室溫溫度是指 2025℃ ，但具體操作時可根據(jù)說明書的要求控制溫育。室溫溫育時， ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。 ? 洗滌 洗滌在 ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。 ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物 質洗滌下來?？梢哉f在 ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。 洗滌的方式除某些 ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作主要為浸泡式，過程如下： ； （將洗滌液注滿板孔后，即甩去）； ，即將洗滌液注滿板孔，放置 12分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短； 內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干； c和 d，洗滌 34次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。 ? 顯色和比色 ? 、 顯色 顯色是 ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應 的