【文章內(nèi)容簡介】 色熒光標記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)測序和半導體芯片測序。 技術(shù)特點高通量測序技術(shù)不僅可以進行大規(guī)模基因組測序，還可用于基因表達分析、非編碼小分子的鑒定、轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選和甲基化等相關(guān)研究。主要優(yōu)點：高通量測序技術(shù)有三大優(yōu)點是傳統(tǒng)測序法所不具備的。第一，它利用芯片進行測序，可以在數(shù)百萬個點上同時閱讀測序。第二，高通量測序技術(shù)有定量功能，樣品中被測序的次數(shù)反映了樣品中這種的豐度。第三、利用傳統(tǒng)測序法完成的人類基因組計劃總計耗資億美元，而現(xiàn)在利用高通量測序技術(shù)進行人類基因組測序，測序成本只需千美金。局限性：檢測靈敏度和測序深度相關(guān)，一般來說，在腫瘤體細胞突變檢測時，檢測靈敏度為；已知的與腫瘤相關(guān)驅(qū)動基因數(shù)量有限，疾病表型和基因型的關(guān)系還有賴于生物信息的解讀，目前應(yīng)用于腫瘤細胞突變檢測的標準化和質(zhì)量控制尚未形成共識。.4 擴增阻滯突變系統(tǒng) （）法 技術(shù)原理擴增阻礙突變系統(tǒng)（ , ）是技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱等位基因特性（ ）等，用于對已知突變基因進行檢測。該法通過設(shè)計兩個`端引物，一個與正?；パa，一個與突變互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及`端引物進行兩個平行，只有與突變完互補的引物才可延伸并得到擴增產(chǎn)物。如果錯配位于引物的` 端則導致不能延伸。 技術(shù)特點是目前實驗室常用的基因突變檢測方法。9 / 38主要優(yōu)點：法檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細胞中突變比例為甚至更低的突變基因。局限性：只能檢測已知的突變類型，不能發(fā)現(xiàn)一些新的、未知的突變；如果檢測的突變位點或類型較多，則隨著引物數(shù)目增加出現(xiàn)非特異性結(jié)合的概率也相應(yīng)增加；當檢測位點較多時，對樣本量的需求增加。.5 高分辨率熔解曲線（）法 技術(shù)原理高分辨率熔解曲線（ ， ）是一種基于新型技術(shù)，用于檢測基因變異包括未知的基因變異、單核苷酸多態(tài)性以及基因甲基化。是基于在加熱過程中雙鏈變性為單鏈的原則。雙鏈體的熔解溫度差異反應(yīng)了基因的變異。雙鏈片段在其特定的溫度熔解，熔解的溫度由片段的含量、序列組成、長度以及一個和多個雜合堿基決定。用嵌合的染料可以看到任何雙鏈片段的熔解峰圖，在有熒光嵌合染料的情況下擴增片段，擴增后的產(chǎn)物通過一個快速的可控的加熱處理開始熔解。熒光水平在升溫的過程中實時監(jiān)測，染料隨著雙鏈的熔解，熒光信號逐漸減少。 技術(shù)特點由于分析不受堿基突變位點和種類的限制，可用于突變掃描、基因分型、序列匹配、甲基化等方面的研究。主要優(yōu)點：檢測靈敏度，特異性高，重復(fù)性好；封閉體系，減少污染的可能性；擴增和檢測同時進行，無需后進行處理。 局限性：通過熔解曲線的圖不能判斷某一特異性的變異體，下游分析中檢測需要有測序等補充。 數(shù)字（ ） 技術(shù)原理數(shù)字是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于，數(shù)字能夠直接數(shù)出分子的個數(shù)，對起始樣品絕對定量。通過將一個樣本分成幾萬到幾百萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標分子進行 擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進行10 / 38統(tǒng)計學分析。數(shù)字技術(shù)不斷發(fā)展， 、 、及等廠家相繼推出技術(shù)較為成熟的數(shù)字產(chǎn)品。 技術(shù)特點數(shù)字目前的應(yīng)用包括：稀有等位基因檢測、基因表達絕對定量、核酸標準品絕對定量、二代測序文庫絕對定量等。主要優(yōu)點：靈敏度可達，高特異性，可檢測復(fù)雜背景下的靶標序列；可高度耐受反應(yīng)抑制劑；不必依賴對照品或標準品，可對目標拷貝數(shù)直接進行精確的鑒定，分析微小的濃度差異；實驗數(shù)據(jù)分析便捷，每個微滴的檢測結(jié)果以陰性、陽性判讀，數(shù)據(jù)分析自動化；可統(tǒng)計突變率，通過統(tǒng)計分析可得出靶點的突變率。局限性：數(shù)字儀通量較低，目前通常能檢測的信號為和。一般單個反應(yīng)重反應(yīng)效果最佳；數(shù)字優(yōu)點是靈敏度高，但是對于濃度大的樣本處理就沒有優(yōu)勢，而且核酸濃度高時，每個微滴里面包含的拷貝數(shù)不符合泊松分布；數(shù)字雖然不依賴標準曲線，但是每次反應(yīng)之間存在差異，短期內(nèi)不能代替，也不能代替其他金標準而作為首選方法。等數(shù)字儀目前僅用于科研用途，數(shù)字走向臨床檢驗還需要一段時間。.7 熒光原位雜交（） 技術(shù)原理熒光原位雜交( , )是通過熒光標記的探針與細胞核內(nèi)的靶序列雜交，并在熒光顯微鏡下觀察分析其結(jié)果的一種分子細胞遺傳學技術(shù)。它的基本原理是：如果被檢測的染色體或纖維切片上的靶與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性退火復(fù)性，即可形成靶與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測進行定性、定量或相對定位分析。 技術(shù)特點主要可對基因缺失、基因融合、基因擴增進行檢測。11 / 38主要優(yōu)點：可多種熒光標記，顯示片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確；靈敏、特異性好，可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復(fù)雜核型。局限性：檢測對操作和判讀技術(shù)要求較高，診斷醫(yī)師必須經(jīng)過嚴格的操作和結(jié)果判讀培訓，只有經(jīng)操作經(jīng)驗豐富的醫(yī)師判定的結(jié)果才具有可靠性；目前檢測的成本昂貴、通量低。.8 免疫組化（） 技術(shù)原理免疫組化（， ）分析利用抗體和抗原之間的結(jié)合的高度特異性，借助于組織化學的方法將抗原抗體結(jié)合的部位和強度顯示出來，以其達到對組織或細胞中的相應(yīng)抗原進行定性、定位或定量的研究。 技術(shù)特點作為篩查工具優(yōu)于，具有經(jīng)濟快捷的優(yōu)點，尤其適用于大量樣本的檢測分析。影響結(jié)果的因素主要包括抗體的選擇、檢測前組織的固定，觀察者解釋方面的差別等。.9 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄() 技術(shù)原理逆轉(zhuǎn)錄（ ）或者稱反轉(zhuǎn)錄( , )，是聚合酶鏈式反應(yīng) ()的一種廣泛應(yīng)用的變形。由一條單鏈轉(zhuǎn)錄為互補()稱作“逆轉(zhuǎn)錄” ，由依賴的聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴的聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即通常的。原先的模板被酶 降解，留下互補。 技術(shù)特點熒光定量是檢測拷貝數(shù)變化的一種快速且經(jīng)濟的技術(shù)方法，該方法技術(shù)可用于表達水平檢測該技術(shù)主要優(yōu)點是檢測快速、通量高、靈敏度好，主要不足是對腫瘤組織提取的質(zhì)量要求較高，在檢測基因表達量時判讀標準尚未統(tǒng)一。 、和三種方法在檢測基因重排時的優(yōu)缺點分析見表 。表：、和檢測基因重排的優(yōu)缺點比較檢測對象 蛋白12 / 38特異性發(fā)現(xiàn)的融合類型 已知、未知 已知、未知 已知通量費用.3 檢測方法選擇策略實驗室應(yīng)優(yōu)選國際和國內(nèi)“金標準”的檢測方法，同類方法中優(yōu)先選擇結(jié)果穩(wěn)定性、重復(fù)性好、特異性高的技術(shù)，同時也應(yīng)考慮樣本量，檢測項目的多少等，綜合選擇合適的方法。由于腫瘤組織的異質(zhì)性，檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提取的質(zhì)量和數(shù)量有限，就檢測靈敏度而言，目前焦磷酸測序測序。在檢測腫瘤基因突變時，不能一味追求檢測方法的靈敏度，靈敏度高的檢測方法對整個實驗過程中的質(zhì)控要求更為嚴格，需防止因污染而產(chǎn)生假陽性。在腫瘤靶基因表達檢測時，由于腫瘤樣本的不可再生性，需謹慎選擇使用的方法，如選用熒光定量要求提取的總量達181。以上，如果腫瘤組織過小，提取的量可能達不到檢測要求，此時應(yīng)考慮選用對樣本量要求低的檢測方法。 檢測項目本指南根據(jù)檢測靶分子（或）類型及基因表達調(diào)控機制類型的不同，將腫瘤個體化治療檢測項目分為基因突變、基因表達、融合基因、基因甲基化檢測四個類型。所述檢測項目均為目前在腫瘤臨床診療中，經(jīng)過嚴格的循證醫(yī)學實驗，且具有明確的臨床應(yīng)用價值，詳見附錄。實驗室在開展腫瘤個體化檢測項目時，應(yīng)評估所開展的檢測項目的科學性，并遵循實驗室的質(zhì)量管理相關(guān)規(guī)定。 提取方法與質(zhì)量控制提取之前的病理質(zhì)量控制非常重要，它決定了最終檢測結(jié)果的可靠性。樣本進行檢測前均先行常規(guī)病理檢查和診斷（染色） ，必須經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)師確定腫瘤細胞的百分比(腫瘤細胞／整張切片所有細胞，必要時應(yīng)采取富集腫瘤細胞的方法，如手工刮取或顯微切割法。選取以腫瘤細胞為主的、沒有明顯的壞死、黏液和炎性改變的組織進行檢測。13 / 38腫瘤細胞比例尚無統(tǒng)一標準，理想情況下，石蠟樣本中腫瘤細胞的比例不應(yīng)低于，新鮮樣本不低于，對于等敏感性較高的方法，腫瘤細胞的含量和比例可以低一些。具體視所采用的提取方法和突變檢測方法的敏感度等而定。對于新鮮和凍存的手術(shù)組織樣本，可采用常規(guī)的商品化提取試劑盒。對于活檢樣本，推薦使用能提取石蠟包埋組織微量的試劑盒。對于商品化核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。純化的靶核酸的完整性可使用凝膠電泳將樣本的核酸提取物與核酸標準品比較測定。 核酸提取的產(chǎn)率：可在讀數(shù)測定，可溶于溶液中，建議濃度控制在，總量 181。 或以上。核酸純度：可通過提取物比率判定，的比值為，的比值為。若比值高于，說明制劑中尚未除盡。 、溶液中含有酚和蛋白質(zhì)將導致比值降低。 提取方法與質(zhì)量控制提取常比較困難，尤其是保存年限較長的腫瘤組織，降解非常嚴重。造成降解的原因有兩個方面：核糖殘基的’和’位置帶有羥基，易被水解；生物體內(nèi)和外部環(huán)境中存在大量酶，并且酶不易失活，高溫后仍然能夠正確折疊恢復(fù)活性。因此從樣本的儲存、的提取及保存，都需要格外小心，防范對的降解作用。提取的經(jīng)典方法是胍鹽提取結(jié)合酚氯仿抽提，石蠟樣本或活檢樣本可使用商品化提取試劑盒純化。細胞或組織的徹底勻漿是提取過程中關(guān)鍵的步驟，它能夠防止的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細胞或組織的類型來選擇。核酸提取的產(chǎn)率：可溶于無的純水中，建議濃度控制在以上，總量達 181。 以上。純化后的應(yīng)測定比值，：＜＜（＜時表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞時表明可能有異硫氰酸殘存） ，進行瓊脂糖凝膠電泳觀察有無污染和的完整程度。 試劑的選擇、儲存及使用注意事項臨床檢測試劑必須為批準的試劑，或具有嚴格標準操作規(guī)程（）的自配試劑（） 。14 / 38所采用的測定方法特異性好，靈敏度、準確度、精密度符合國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心、 、等推薦的方法性能。所用標準品或標準參考物符合國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心推薦的標準和要求。 核酸擴增質(zhì)量控制臨床檢測方法不但要求特異性好、靈敏度高、還要求具有高的可重復(fù)性、準確性，盡量降低假陽性、假陰性和非特異性擴增。臨床樣本擴增時，經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和假陰性，導致檢測結(jié)果得出錯誤結(jié)論，有時可造成嚴重后果。在核酸提取中，應(yīng)至少帶有份已知弱陽性質(zhì)控樣本。其最后的檢測結(jié)果，應(yīng)是核酸提取和擴增檢測有效性的綜合反映。同時，還應(yīng)至少帶一份已知陰性質(zhì)控樣本，擴增測定的結(jié)果可以判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染。如靶核酸為，為判斷擴增的有效性，可使用份已制備好的弱陽性靶樣本，直接與靶核酸同時擴增檢測。如靶核酸為，則除了可用上述弱陽性判斷擴增有效性外，還可用已制備好的弱陽性質(zhì)控來判斷反轉(zhuǎn)錄的有效性。另外，須設(shè)立陰性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明實驗全部過程的試劑沒有受到核酸污染。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結(jié)果成立的前提下，才能對檢測樣品擴增結(jié)果進行判定。 設(shè)備維護和校準實驗室儀器的保養(yǎng)與維護是實驗室實驗技術(shù)員的重要組成部分，儀器的保養(yǎng)與維護關(guān)系到儀器的適用率、數(shù)據(jù)的準確率。儀器設(shè)備安裝及技術(shù)性能驗收需由項目負責人、儀器設(shè)備使用人、實驗室技術(shù)人員共同完成，驗收內(nèi)容按采購合同中技術(shù)需求部分以服務(wù)協(xié)議書的要求逐項進行，并且建立儀器設(shè)備檔案。儀器設(shè)備應(yīng)定期開展校準計量，未經(jīng)計量檢定、計量檢定不合格或未驗收的對測試有重要影響的儀器設(shè)備不得投入使用。實驗室日常工作中，應(yīng)重視儀器設(shè)備的清潔及維護，做到日維護、周維護、月維護，并及時記錄。 人員培訓檢測人員應(yīng)該有相關(guān)的教育背景、相應(yīng)的工作經(jīng)驗，接受過專業(yè)培訓。培訓主要有內(nèi)部和外部培訓，內(nèi)部培訓包括所使用的試劑方法原理、儀器設(shè)備操15 / 38作維護及校準、質(zhì)量控制等，外部培訓包括國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心和國家衛(wèi)生計生委個體化醫(yī)學檢測培訓基地等機構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓。 方法的性能驗證方法學引進初期需對檢測系統(tǒng)測定項目各參數(shù)的實驗或評估性驗證，包括精密度、準確度、線性范圍、臨床可報告范圍、特異性、檢測下限、抗干擾能力等。所有項目的方法驗證應(yīng)形成詳細的資料備存，資料需詳細描述方法驗證的目的、過程、檢測結(jié)果、分析判斷及驗證結(jié)論。驗證的結(jié)果及結(jié)論須經(jīng)實驗室負責人簽字后才能用于臨床檢測。根據(jù)項目的特性，一些方法驗證指標不需進行或未進行時，需在報告中書面解釋原因。推薦用打印的文稿并在專用文件夾保存。具體的性能驗證方法，如使用的是經(jīng)批準的試劑，可參照試劑盒說明書上相應(yīng)的性能指標部分進行驗證，看是否能在其實驗室內(nèi)復(fù)現(xiàn)說明書所顯示的上述性能指標。如為自制試劑或自建方法，則參考技術(shù)指南進行性能評價，建立上述性能指標。以下方法可供參考?！緶蚀_度】）參加國家衛(wèi)生計生委臨檢中心組織的室間質(zhì)評，從室間質(zhì)評統(tǒng)計結(jié)果評價實驗室檢測結(jié)果的偏倚或符合情況，從而評價和驗證實驗室檢測結(jié)果的準確性。）方法比較實驗：當引進新方法與原有方法進行比較時，最少樣本數(shù)為例，用兩種方法同時測定同樣的樣品。如結(jié)果有不符合時，應(yīng)采用第三種方法或試劑進行確認。）檢測已知值的標準物質(zhì)，對于樣本來源存在問題的檢測方法，可以對已知值的樣本稀釋成不同濃度再檢測，以評估其準確度?！眷`敏度】）分析靈敏度：就是確定檢測方法的檢測下限：將一份已知定值的標準品，用野生型的基因組稀釋突變型基因組，設(shè)定不同的突變含量，一直稀釋到檢測下限以下為止，平行檢測管，管全部檢出且其線性∣∣≥的最低稀釋濃度即為該方法的檢測下限。 （可根據(jù)實際情況在最低稀釋濃度附近進行倍以下的稀釋）16 /