【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 1 小時(shí)。滅菌結(jié)束后及時(shí)取出，以免在鍋內(nèi)被余熱烘干。（二）制作過(guò)程1．拌料先根據(jù)培養(yǎng)料成分配方和要做的原種和生產(chǎn)種的數(shù)量，計(jì)算出各種原料的數(shù)量，然后稱量，混合，加水拌料（一般加水量是原料干重的 — 倍） 。拌時(shí)要求均勻一致，邊拌料邊加水，邊試含水量，以便控制水分不致過(guò)多或過(guò)少。2．測(cè)含水量料拌好后，要測(cè)一下含水量，一般要求在 60—65%。測(cè)法是將培養(yǎng)料握在手中捏緊，手指縫中有水印但無(wú)水滴流下即可。3．分裝，封瓶口培 養(yǎng) 料 配 制 好 后 ， 進(jìn) 行 分 裝 ， 一 般 裝 入 500～ 750 毫 升 的 罐 頭 瓶 或 菌 種 瓶 ， 裝瓶 時(shí) 隨 裝 隨 壓 緊 ， 松 緊 要 適 當(dāng) ， 過(guò) 緊 通 氣 不 良 發(fā) 菌 慢 ； 過(guò) 松 ， 菌 絲 生 長(zhǎng) 稀 疏 無(wú) 力 ，裝 量 一 般 占 瓶 容 量 的 4／ 5 或 至 瓶 肩 ， 最 后 將 料 面 壓 平 ， 如 是 木 屑 培 養(yǎng) 基 ， 還 要 用一 根 錐 形 木 棒 在 瓶 中 打 一 直 達(dá) 瓶 底 的 洞 （ 洞 直 徑 上 部 厘 米 ， 下 部 1 厘 米 ） 以 便菌 絲 生 長(zhǎng) 繁 殖 ， 然 后 洗 凈 瓶 口 瓶 壁 ， 塞 上 棉 塞 ， 再 包 上 牛 皮 紙 ， 也 可 以 不 用 棉 塞 ，用 一 層 聚 丙 烯 薄 膜 （ 或 耐 壓 聚 乙 烯 薄 膜 ） 上 加 一 層 牛 皮 紙 或 報(bào) 紙 ， 包 扎 起 來(lái) 封 住瓶 口 。4．滅菌（1）高壓蒸汽滅菌，一般采用大型臥式或立式高壓鍋，需 — 公斤／厘米 2 的蒸汽壓 126℃，經(jīng) —2 小時(shí)才可達(dá)到徹底滅菌的目的。（2）常壓蒸汽滅菌：利用一般蒸籠或土消毒鍋，在常壓以 100℃的溫度下持續(xù) 6—8 小時(shí)。11 / 124第四節(jié) 滅菌與消毒空氣、水滴、沙土、塵埃，各種生物體及物表面或孔隙內(nèi)，均存在大量的細(xì)菌。真菌孢子等，為了使培養(yǎng)基質(zhì)能獲得純菌絲體，就必須采用物理或化學(xué)方法等手段進(jìn)行滅菌或消毒。但這兩者是不同的概念，往往被人們所混淆。消毒：采用物理、化學(xué)的方法除去物品表面上的病原菌，是一種不徹底的滅菌方法。滅菌：采用物理、化學(xué)的方法，使附著在物體孔隙內(nèi)的微生物致死。是一種徹底的滅菌方法。滅菌方法：常用滅菌方式有熱力滅菌、過(guò)濾滅菌、化學(xué)滅菌、輻射滅菌等四種。一、熱力滅菌（一）火焰滅菌法將那些能耐受高溫而不破壞的器物，金屬用具直接放在火焰上燒灼，使隨著在物體表面的細(xì)胞和孢子等燒焦，稱為火焰滅菌?；鹧鏈缇m用于接種鏟、針、耙等移植工具的滅菌，野外采集工具如小刀或解剖刀刃部滅菌。（二）干熱滅菌法把能抗干熱的器材物，如待滅菌的吸管、培養(yǎng)皿、試管、空三角瓶等玻璃器具及不能與蒸氣充分接觸的液體石臘等放入烘箱內(nèi)在 160℃以上烘烤 －1 小時(shí)即可達(dá)到滅菌目的，滅菌器物入烘之前必須預(yù)先洗凈，烘干，用干凈紙張或皮包好，玻璃培養(yǎng)皿最好裝進(jìn)密封性能較好的金屬罐內(nèi)，并注明滅菌日期。（三）濕熱滅菌利用蒸汽或沸水滅菌，稱為濕熱滅菌。由于濕熱滅菌的穿透力比干熱滅菌大，殺傷能力強(qiáng)，蛋白質(zhì)，原生質(zhì)膠體在濕熱條件下容易變性凝固，酶系統(tǒng)容易被破壞，蒸汽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)凝結(jié)成水，能放出潛在熱量而提高溫度，更加增強(qiáng)殺菌力，常用的濕熱滅菌方法有如下幾種：1．高壓蒸汽滅菌法利用高溫高壓蒸汽進(jìn)行滅菌的方法。高壓蒸汽滅菌可以殺死一切微生物。包括細(xì)菌的芽孢，真菌的孢子或休眠體等耐高溫的個(gè)體，滅菌的溫度隨蒸汽壓力增加而升高，增加蒸汽壓力，滅菌的時(shí)間可以大大縮短，因此它是一種最有效的，使用最廣泛的滅菌方法。蒸汽壓力與蒸汽溫度的關(guān)系。見(jiàn)表 2－1：表 2－1 蒸汽壓力與溫度關(guān)系表蒸汽壓力大氣壓 公斤/ 厘米 2 磅/吋 2； 蒸汽溫度100107 11212 / 124 121 128 高壓滅菌所采用的蒸汽壓力與滅菌時(shí)間，應(yīng)報(bào)據(jù)具體滅菌物質(zhì)而定，母種，液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)，一般采用 公斤／厘米 2 壓力，溫度 121℃滅菌 30 分鐘。原種栽培種等固體培養(yǎng)基滅菌時(shí)，通常用作 公斤/ 厘米 2 壓力．溫度 128℃，滅菌 － 小時(shí)，如制備蘑菇栽培種河泥糞料培養(yǎng)基，滅菌時(shí)間或滅菌壓力要有所增加。通常壓力為 2 公斤/厘米 2，滅菌時(shí)間為 2— 小時(shí)。使用高壓蒸汽滅菌時(shí)，注意以下幾點(diǎn)：（1）滅菌鍋內(nèi)的冷空氣必須排盡，冷空氣的熱膨脹系數(shù)大，若滅菌鍋內(nèi)留有冷空氣，當(dāng)滅菌鍋密閉加熱時(shí)，冷空氣受熱很快膨脹，使壓力上升，造成滅菌鍋內(nèi)壓力與溫度不一致，產(chǎn)生假性蒸汽壓，鍋內(nèi)溫度低于蒸汽壓表示的相應(yīng)的溫度，致使滅菌不徹底。排除冷空氣的方法有兩種：緩慢排氣和集中排氣。緩慢排氣法，即開(kāi)始加熱滅菌時(shí)便打開(kāi)排氣閥門(mén)，隨滅菌鍋內(nèi)溫度逐漸上升，鍋內(nèi)的冷空氣逐漸排出，當(dāng)鍋內(nèi)溫度上升到 100℃，大量蒸汽從排氣閥中排出時(shí)（可看到藍(lán)色光帶）即可關(guān)閉排氣閥，進(jìn)行升壓滅菌。集中排氣法，即在開(kāi)始加熱滅菌時(shí)，先關(guān)閉排氣閥，當(dāng)壓力升到 ，打開(kāi)排氣閥，集中排出空氣，讓壓力降到零，并有大量蒸汽排出時(shí)，再關(guān)閉排氣閥進(jìn)行升壓滅菌。固體培養(yǎng)基滅菌時(shí)，可采用集中排氣法。流體培養(yǎng)基滅菌時(shí)一般不宜采用，以免液體沖出瓶口。（2）滅菌鍋內(nèi)的培養(yǎng)基必須排列疏松，使蒸汽暢通。滅菌鍋內(nèi)蒸汽是否暢通，關(guān)系到滅菌溫度均一。滅菌材料放得過(guò)多，過(guò)密，會(huì)妨礙蒸汽的流通，影響溫度分布的均一，造成局部地區(qū)溫度較低，甚至形成溫度“死角” ，達(dá)不到徹底滅菌，常常導(dǎo)致以后雜菌污染。（3）滅菌完畢，應(yīng)緩慢減壓。高壓蒸汽滅菌結(jié)束后的排氣降壓不能太快，若排氣太快，瓶?jī)?nèi)外的壓力差就會(huì)增大，引起瓶塞沖出瓶口；液體培養(yǎng)基滅菌時(shí)，液體會(huì)突然沸騰，弄臟瓶塞；塑料袋培養(yǎng)料滅菌時(shí)，應(yīng)讓其自然冷卻，當(dāng)壓力降到 ／cm 2 左右時(shí)，再打開(kāi)排氣閥以免在減壓過(guò)程中，袋內(nèi)外產(chǎn)生壓力差，把塑料袋擊穿，導(dǎo)致以后雜菌污染。（4）注意棉塞防濕。用棉塞塞的瓶口或試管，在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌時(shí)，因鍋中熱蒸汽在鍋壁四周和鍋蓋內(nèi)側(cè)容易產(chǎn)生凝結(jié)水，凝結(jié)水沿著鍋壁和鍋蓋下流，弄濕棉塞。潮濕的棉塞在培養(yǎng)過(guò)程中，容易生長(zhǎng)鏈孢霉或其他霉菌，污染培養(yǎng)物，為了防止棉塞潮濕，滅菌時(shí)，瓶子的棉塞不能接觸滅菌鍋壁，瓶子上面蓋防水油紙，滅菌結(jié)束時(shí)，應(yīng)先排放鍋內(nèi)熱水，然后再慢慢排放蒸汽降壓，看棉塞13 / 124潮濕?？稍阱亙?nèi)烘烤一定時(shí)間再取出來(lái)。2．常壓滅菌法采用自然壓力的蒸汽滅菌的方法。阿諾氏（Arno1d）流通蒸汽滅菌器是微生物技術(shù)中常用的設(shè)備。我國(guó)食用菌菌種生產(chǎn)過(guò)程中，有的利用蒸籠滅菌，有的利用鋼筋水泥砌成的大型的流通蒸汽滅菌灶。一次可滅菌 12 千瓶原種或栽培種培養(yǎng)基。流動(dòng)蒸汽的溫度一般為 100℃左右，滅菌時(shí)間一般為 6—8 小時(shí)，這種專用流通蒸汽滅菌灶的最大優(yōu)點(diǎn)是：容量大，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低，可自行建造，缺點(diǎn)是：滅菌時(shí)間長(zhǎng)，能源消耗量大，稍不注意就有滅菌不徹底的現(xiàn)象發(fā)生。3．間歇滅菌法指間歇一定時(shí)間，連續(xù)消毒幾次達(dá)到滅菌的方法，此方法適用于不耐高溫而其他方法滅菌效果都不好時(shí)采用。二、過(guò)濾滅菌細(xì)菌、真菌及其孢子，個(gè)體雖小，直徑也僅在幾毫微米，如用密孔過(guò)濾器將溶液過(guò)濾也可將之排除，常用到一些有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分如維生素、氨基酸、某些抗菌素等，由于不耐高溫，前述滅菌方法不適宜，應(yīng)采用細(xì)菌過(guò)濾器滅菌。此法滅菌對(duì)細(xì)菌過(guò)濾器要求很高，每用一次都要用稀鹽酸浸泡幾天再用濃鹽酸洗濾，最后用無(wú)菌水清洗至無(wú)酸跡，細(xì)菌過(guò)濾器不能將病毒完全除去成為無(wú)菌狀態(tài)，現(xiàn)在常用濾膜過(guò)濾器代替細(xì)菌過(guò)濾器，可濾掉病毒。三、輻射滅菌輻射，是通過(guò)波動(dòng)或粒子在空間高速運(yùn)行而傳遞能量的一種物理現(xiàn)象。利用輻射產(chǎn)生的能量進(jìn)行滅菌的方法，稱之輻射滅菌。輻射可分電離輻射和非電離輻射兩種，α 射線，β 射線，γ －射線，χ 射線，中子和質(zhì)子等屬電離輻射，紫外線、日光為非電離輻射。其中紫外線殺菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生等方面。紫外線波長(zhǎng)范圍在 3900－136A 之間，其中波長(zhǎng) 2022 一 3000A 的紫外線具有殺菌作用，尤以 2650－2660A 波長(zhǎng)殺菌力最強(qiáng)，無(wú)菌室接種室內(nèi)安裝的人工紫外紅燈管，一般照射 20－30 分鐘，即可殺死空氣中的微生物。但紫外線穿透很弱，只適用于空氣和物體表面的消毒。我國(guó)蘑菇生產(chǎn)中使用的覆土，在日光下曝硒，就是利用日光及其中的紫外線殺菌的一種方去。四、化學(xué)滅菌與消毒利用化學(xué)藥劑進(jìn)行滅菌或抑菌的方法。一般用于殺死微生物的藥劑稱消毒劑；用于抑制微生物生長(zhǎng)的藥劑稱抑制劑或防腐劑。實(shí)際上兩者并無(wú)嚴(yán)格的區(qū)別，因?yàn)橄緞┰诘蜐舛葧r(shí)呈現(xiàn)抑菌作用，防腐劑在高濃度時(shí)呈現(xiàn)殺菌作用，所以統(tǒng)稱為消毒防腐劑。殺菌的化學(xué)藥劑種類很多，常見(jiàn)的有以下幾種：（一）重金屬鹽類所有重金屬鹽類對(duì)微生物有毒害作用，如汞、銀、鉛、鋅、銅等。微生物浸14 / 124在 －%硝酸鹽（AgNO 3） ，升汞（HgCl 2）等溶液中，幾分鐘就會(huì)死亡。蘑菇采種及段木分離菌種時(shí)，常用 %升汞溶液進(jìn)行表面消毒。升汞（HgCl 2）白色結(jié)晶粉末，能溶于水，在鹽酸或氯化鈉存在下，其溶解度提高，殺菌力提高，常配成 %升汞水溶液，其配制方法：（1）升汞 1 克，食鹽 克，水 1000 毫升；（2）升汞 1 克，濃鹽酸 毫升加水 1000 毫升。（二）氧化劑常用的氧化劑有 %高錳酸鉀（KMn0 4） 、過(guò)氧化氫（H 202） 、臭氧（0 3） 、過(guò)氧乙酸（CH 3COOOH） 、漂白粉（CaOCl 2）等。高錳酸鉀、過(guò)氧化氫常用濃度 %，過(guò)氧乙酸為 —%，漂白粉 －%，以上藥劑隨用隨配，稀釋液只能存放3 天。它們的殺菌機(jī)制是通過(guò)強(qiáng)烈的氧化作用，破壞微生物的原生質(zhì)或酶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。（三）還原劑甲醛（HCH0）是常用的還原清毒劑商品的原液濃度為 40%，5%的福爾馬林溶液用于防腐和種子表面消毒，可殺死細(xì)菌的芽孢和真菌孢子，培養(yǎng)室、接種室或蘑菇房消毒時(shí)，以福爾馬林原液熏蒸，每立方米 8 毫升福爾馬林原液，再加 5克高錳酸鉀，加熱蒸發(fā)。甲醛能與微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合。引起蛋白質(zhì)變性，使原生質(zhì)失去正?；顒?dòng)能力。（四）表面活性物質(zhì)乙醇（酒精） 、石碳酸、來(lái)蘇兒、新潔爾滅等，均是表面活性消毒劑。1．乙醇（C 2H6O）是強(qiáng)表面活性劑，也是最常用的表面消毒劑，能降低表面張力，改變細(xì)胞膜的滲透性及原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，使蛋白質(zhì)凝固變性。75%的乙醇消毒力最強(qiáng)。2．石碳酸（苯酚 C6H6O）低溫下為無(wú)色或白色針狀，有特殊抗性和腐蝕性．在空氣中易氧化變紅色，熔點(diǎn) 42—43℃，65℃ 以上能與水任意混合，一般用 5%苯酚化溶液作消毒劑，配制時(shí)先用熱水溶化再加入需水量。3．來(lái)蘇爾（煤酚皂溶液 C6H4CH3OH）黃棕色至紅棕色粘稠液體，有酚臭可溶于水及醇中，殺菌力為石碳酸 4 倍，1—2%來(lái)蘇爾溶液可適于皮膚浸泡， （2 分鐘） ，2－3%可用噴灑消毒，常與新潔爾滅、石碳酸交叉使用于接種箱，無(wú)菌室，培養(yǎng)室消毒。4．新潔爾滅（C 21H38NBr）為淡黃色膠狀體。具芳香氣味，極苦，易溶于水，是陽(yáng)離子型表面活化殺菌劑，對(duì)無(wú)芽孢病原菌，霉菌等具有較強(qiáng)的殺菌作用，效果是石碳酸的幾十倍，消毒特點(diǎn)快速、徹底、高效。原液濃度 5%，使用時(shí)可稀釋 20 倍即 %濃度，用于表面消毒，存放一個(gè)月，加大濃度 2%，可用噴灑消毒。15 / 124第五節(jié) 菌種分離和提純分離純菌種是制種工作的重要一環(huán)，也是一項(xiàng)比較細(xì)致的工作。食用菌菌種的分離方法有三種：即孢子分離，組織分離和基內(nèi)菌絲分離。這三種方法適用于不同的菌種。主要適宜于營(yíng)獨(dú)立生活的腐生菌（木腐菌、草腐菌、腐殖質(zhì)腐生菌），有些與高等植物共生的菌根菌，很難在簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基獲得純菌種。一、孢子分離法這種方法的分離對(duì)象是菌類的孢子。即在無(wú)菌操作條件下，使孢子在適宜的培養(yǎng)基上萌發(fā)，長(zhǎng)成菌絲體而獲得純菌種。取得孢子的方法很多。菌類的孢子有性孢子（擔(dān)孢子與子囊孢子）和各種無(wú)性孢子（草菇的原垣孢子、銀耳的酵母狀孢子，節(jié)孢子、黑木耳的分生孢子……） 。在分離時(shí)．可以采取有性孢子分離法，也可以采取無(wú)性孢子分離法，可以利用單孢子分離法。也可以采用多孢子分離法。但在一般菌種生產(chǎn)進(jìn)程中，為了避免異宗結(jié)合的菇類（如香菇、平菇）產(chǎn)生單孢子不孕現(xiàn)象，一般都采用多孢子分離法。單孢子分離法主要應(yīng)用于食用菌的雜交育種工作。（一）種菇的選擇在分離時(shí)必須選擇優(yōu)良品種的優(yōu)良個(gè)體來(lái)作分離材料，如蘑菇應(yīng)選擇床上單生、肥厚、柄粗壯、傘肉奪取實(shí)、早熟、無(wú)病蟲(chóng)菌菌幕將破但還未破者。草菇選擇菌蛋肥厚，腳苞未破者；香菇、平菇選擇個(gè)體強(qiáng)壯，八分成熟子實(shí)體。采集來(lái)的野生品種無(wú)以知道其生產(chǎn)性能的優(yōu)劣，不能馬上用于生產(chǎn)，僅能作育種材料。只有進(jìn)行品種對(duì)比后，證明是優(yōu)良者。才能應(yīng)用于生產(chǎn)。（二）孢子的采集方法獲取孢子的方法很多現(xiàn)分述如下：1．孢子彈射分離法孢子彈射分離法是生產(chǎn)上常用的一種方法，它利用孢子能自動(dòng)彈射出子實(shí)體層的特性，來(lái)收集并分離孢子，根據(jù)不同的裝置又可分為三種：（1）種菇孢子彈射法（也叫整菇插種法） ，就是將整只種菇（蘑菇、香菇、平菇、草菇等）經(jīng)表面消毒后，用無(wú)菌紗布試干水分插入孢子收集器內(nèi)收集孢子。蘑菇、菇可放在經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中置于接種箱中收集孢子，蘑菇如在 12～18℃的環(huán)境下，2～3 天便可彈射大量孢子，香菇、平菇在選擇種菇時(shí)，一定要八分成熟的子實(shí)體（即已看到散發(fā)孢子的個(gè)體） ，并在插入孢子收集器內(nèi) 6～12 小時(shí)取出。這樣種菇孢子先彈射出來(lái)而附在上面的雜菌孢子短時(shí)間內(nèi)不會(huì)落下。（2）鉤懸法在生產(chǎn)上，采集銀耳、木耳等孢子時(shí)常用此法。在無(wú)菌箱內(nèi)，將新鮮成熟的耳片用無(wú)菌水沖洗數(shù)次，然后用無(wú)菌紗布將水汲干，取一小塊掛在鉤子上，