臨床pcr檢驗(yàn)標(biāo)本的采集、處理、保存及核酸提取方法(編輯修改稿)
2025-08-14 04:49 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 搖邊加入無水乙醇至終濃度為 50%.這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日 ,4℃ 可保存 6年 。 ? 石蠟切片用于核酸提取 ,需先用辛烷或二甲苯脫蠟 ,再用蛋白酶 K消化后即可進(jìn)行 DNA提取 。 臨床標(biāo)本的濾紙上保存 ? 臨床標(biāo)本置于經(jīng)過處理的濾紙片上，如靶核酸為 DNA，可室溫保存數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為RNA，則可穩(wěn)定數(shù)周。 ? 保存在濾紙上的標(biāo)本，保存時間長，還可因?yàn)闃?biāo)本中的 PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對后面的擴(kuò)增檢測造成影響。 ? 不管是全血、血清（漿）。還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。 臨床標(biāo)本中 PCR反應(yīng)抑制物 ? 內(nèi)源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。 ? 外源性的 :如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過度 UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有的抑制物。 肝素的作用機(jī)理 ? 肝素對 MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和 TAQ DNA聚合酶均很強(qiáng)的抑制作用，如果臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中， 標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于 DNA和RNA上 ，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。 ? 對標(biāo)本進(jìn)行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用。 肝素的作用機(jī)理 ? 每 μg核酸標(biāo)本中加入 ,即可 100%的抑制酶活性。 ? 在標(biāo)本中加入肝素酶 I 或 Ⅱ 1~3 U/μg核酸 (于 5 mM Tris , 1 mM CaCl2, 40 U RNase 25 ℃ 2小時 ) 可去除肝素的抑制作用。 血紅蛋白、乳鐵蛋白 ? 血紅蛋白和乳鐵蛋白 分別是 紅細(xì)胞 和 白細(xì)胞 內(nèi)的主要 PCR抑制物 ,它們均含有鐵。 抑制機(jī)制 可能是： （ 1） 與這些蛋白釋放鐵離子至 PCR混合物中有關(guān)。研究鐵的抑制效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)其干擾 DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（ Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是 PCR抑制物。 （ 2） 1%(V/V)血液可完全抑制 Taq酶活性 IgG ? IgG的抑制作用是由于其與單鏈 DNA的相互作用，使得靶 DNA不能與 DNA聚合酶相互作用 ? 使用煮沸作為標(biāo)本處理方法或使用PCR前的熱啟動 ,將增強(qiáng) IgG對 PCR反應(yīng)的抑制 去除或減輕抑制的一些方法 ? NaOH處理可中和臨床標(biāo)本中的 Taq DNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適用于 DNA含量低的標(biāo)本，因?yàn)?NaOH處理可使 DNA大量丟失。 去除或減輕抑制的一些方法 ? 加入 % (wt/vol)牛血清白蛋白（ BSA）可降低血液對 Taq DNA聚合酶的抑制效應(yīng)，既使在 2%（ vol/vol）血液存在下亦可成功擴(kuò)增，而通常血液含量只能是 %。 ? BSA也可增加 Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增能力，使其對糞便和肉類標(biāo)本中抑制物的抵抗能力分別提高 10和 20倍。 ? 單鏈 DNA結(jié)合 T4基因 32蛋白（ gp32）有類似 BSA的增強(qiáng)效應(yīng)。 核酸純化 ? 核酸分離純化技術(shù)起源于二十世紀(jì)五十年代，在七十年代和八十年代中傳統(tǒng)的核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍的應(yīng)用和推廣。 ? 傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。 一般核酸提取試劑促使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理 ? 靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測定的是病原微生物 ,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂 ,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。 ? 一般均使用去垢劑 (如 Triton100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶 (如蛋白酶 K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。 核酸的分離純化 ? 核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。
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