半夏瀉心湯及其拆方對(duì)大鼠胃組織縫隙鏈接蛋白cx43表達(dá)的doc(編輯修改稿)
2025-08-13 23:30 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 iotech）；紫外分光光度儀（Pharmacia，美國(guó)）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀MX3000P（Stratagene，美國(guó)）。將大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組。正常組10只，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組80只，以不規(guī)則喂養(yǎng)方法飼養(yǎng)4周，即動(dòng)物每逢單日正常進(jìn)食、雙日禁食，以打亂其正常的飲食節(jié)律。自由飲水，水中加入鹽酸（每升水加10mol/L鹽酸10ml），以破壞胃內(nèi)酸堿環(huán)境，制備大鼠胃電節(jié)律失常模型［78］。各組均采用大鼠全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。大鼠不規(guī)則喂養(yǎng)4周后參考文獻(xiàn)［78］進(jìn)行胃電生理學(xué)評(píng)價(jià)，分析胃電慢波節(jié)律。模型大鼠胃電節(jié)律異常，胃動(dòng)過(guò)速、胃動(dòng)過(guò)緩和節(jié)律紊亂，與正常組比較有顯著差異，造模成功。將標(biāo)記好的80只模型大鼠隨機(jī)分為八組，即模型組（M）、辛開(kāi)組（X）、苦降組（K）、甘補(bǔ)組（G）、辛開(kāi)苦降組（XK）、辛開(kāi)甘補(bǔ)組（XG）、苦降甘補(bǔ)組（KG）、全方組（QF），每組10只。依人單位體重生藥量計(jì)算大鼠單位體重生藥量后，擴(kuò)大10倍，即得大鼠每日喂食用藥量。各用藥組按相同藥物濃度不等體積（5ml／Kg／天）灌胃給予相應(yīng)藥液，每日1次，連續(xù)灌藥4周。正常組和模型組給予同體積生理鹽水灌胃。 胃電生理學(xué)評(píng)價(jià)給藥四周后，大鼠禁食18h，%水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉，固定后腹部備皮，常規(guī)消毒，于劍突下正中切開(kāi)腹壁1～2cm，暴露胃竇部，兩電極間距3mm，還原暴露的胃組織；接地電極插入大鼠腿部肌肉處固定。將三股電極連接于多導(dǎo)生理儀上。,胃電橫軸時(shí)間以1min為單位，縱軸振幅以2mV為單位進(jìn)行胃電記錄，每次記錄30分鐘。胃電記錄完畢，用2／0縫合線縫合皮膚切口，碘伏擦拭切口。術(shù)后每只大鼠腹腔注射青霉素40萬(wàn)U/d，連續(xù)3d。術(shù)后一周取材。胃電記錄以每10min為一個(gè)時(shí)間段，計(jì)算每只大鼠每一個(gè)時(shí)間段的慢波頻率以及每只大鼠慢波頻率變異系數(shù)［78］，進(jìn)行胃電參數(shù)分析。 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃壁組織Cx43表達(dá)大鼠禁食18h后，％水合氯醛（1ml/100g）腹腔注射麻醉，背位固定，取出胃組織，生理鹽水沖洗干凈后，4％多聚甲醛固定。采用SABC免疫組化檢測(cè)法胃組織Cx43表達(dá)，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Ⅱ圖像拍攝系統(tǒng)，將染色后的病理切片在10倍光鏡下觀察后，在40倍鏡下每例標(biāo)本隨機(jī)選擇肌間神經(jīng)叢的五個(gè)最能反映胃壁全貌的視野，觀察Cx43表達(dá)分布情況，結(jié)果進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)平均光密度值和積分光密度值，計(jì)算IOD值。以細(xì)胞質(zhì)有明確棕色或棕黃色著色而細(xì)胞核無(wú)著色為陽(yáng)性表達(dá)。 實(shí)施熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠胃壁Cx43mRNA的表達(dá) 取胃組織30mg,置于冰上加trizol勻漿，按照常規(guī)操作順序提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260和OD280，計(jì)算總RNA的濃度及純度。取2μg總RNA，在鳥(niǎo)類(lèi)成髓細(xì)胞瘤反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）和Oligo(dT)15條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，70℃10min，4℃5min，42℃30min，95℃5min，4℃5min，獲得cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μl，含2μlcDNA，10μmol/L上下游引物各1μl，5SYBR Green PCR Master Mix10μl。根據(jù)文獻(xiàn)［89］設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：Cx43引物序列：上游5′ACTTCAGCCTCCAAGGAGTTC3′，下游5′CATGTCTGGGCACCTCTCTTT3′，產(chǎn)物大小為80bp；以GAPDH作為內(nèi)參照。GAPDH上游5′GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGA3′，下游5′CCGTTCACACCGACCTTCACCAT3′產(chǎn)物大小為95bp。2條引物的擴(kuò)增效率均為90％～100％。GAPDH、Cx43擴(kuò)增條件為：95℃5min預(yù)變性；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共40做個(gè)循環(huán)；95℃1min，55℃30s，95℃30s1個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)立三個(gè)復(fù)孔，取均值。將所得Ct值按照2－△△ct的方法進(jìn)行均一化處理，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)177。標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。，剔除各組數(shù)據(jù)由隨機(jī)誤差及人圍因素導(dǎo)致的過(guò)高或過(guò)低的測(cè)量值，隨后先進(jìn)行正態(tài)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)K個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)；服從正態(tài)分布時(shí)，采用方差齊性檢驗(yàn)。方差齊時(shí)采用單因素方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)；各給藥組與模型組的比較采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)；各給藥組之間兩兩比較采用Tukey39。s Multiple Comparison Test檢驗(yàn)；各給藥組之間是否有交互作用采用析因分析。2 結(jié)果 各組對(duì)大鼠胃電慢波頻率變異系數(shù)的影響如圖1所示，正常組大鼠胃電節(jié)律正常，模型組大鼠胃電節(jié)律異常，胃動(dòng)過(guò)速或過(guò)緩，節(jié)律紊亂。模型組大鼠胃電慢波頻率變異系數(shù)最大，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P），各給藥組胃電節(jié)律均有不同程度改善，胃電慢波頻率變異系數(shù)低于模型組，各組慢波頻率變異系數(shù)為辛開(kāi)苦降組XK＜辛開(kāi)甘補(bǔ)組XG＜ 全方組Q＜ 甘補(bǔ)組G＜ 苦降甘補(bǔ)組KG＜苦降組K＜辛開(kāi)組X＜ 模型組M，但僅全方組QF、甘補(bǔ)組G、辛開(kāi)苦降
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