【文章內容簡介】 參考文獻[1] 黃躍金，楊鴻群，[J]，心血管病防治，2006，6﹙1﹚：1921[2] Herrmann V, Buscher R, Go MM,et receptor polymorphysim at condon 16,cardiovascular phenotypes and essential hypertension in whites and African Americans. A JH,2000 ,13（1）:10211026[3]Rosenkranz AC, Lob H, Breitenbach T. Endothclial antioxidant actions of dihydropyridines and angiotensin converting enzyme inhibitor[J].Eur J Pharmacol,2006,529 (1) : 5562 [4] Rigat B, Hubert C, AlhencGelas F, et al. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin Iconverting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels,J Clin Invest, 1990,86（1）:13421346[5] Sagnella GA. Rothwell MJ, Onipinla AK, et al. A population study of ethnic varitions in the angiotensinconverting enzyme I/D polymorphism: relationships with gender, hypetension and impaired glucose metabolism. J Hypertens,1999,17（1）:657664[6] Kario K, Kanai N, Saito K, et al. Ischemic stroke and the gene for the angiotensinconverting enzyme in Japanese hypertensives. Circulation, 1996, 93（1）:16301633[7] 梁輝，范金英，[J].中華神經醫(yī)學雜志，2003，2（4）：312314[8] 傅立心，趙建國，[J]. 中華神經醫(yī)學雜志，2005，4（11）：10891091[9] 聶瑩雪，李莉，陳陽，[J].中風和神經病雜志，2000，17（1）：4143[10] 馬曄，馬建芳，陳喜軍. ACE基因多態(tài)性及其血漿水平與老年腦卒中的關系[J] .東南國防醫(yī)藥雜志，2007，9（1）：2123[11] Morris BJ, Zee RY, Schrader AP. Different frequencies of angiotensinconverting enzyme genotypes in older hypertensive individuals[J]. J Clin invest, 1994, 94(10):10851089[12] Moeda Y, Ikeda U, Ebata H, et enzyme gene polymorphism in hypertensives individuals with parental history of stroke,1996,27(12):15211523[13]Slowik A , Turaj W ,Dziedzic T, et al. DD genotype of ACE gene is a risk factor for intracerebral hemorrhage [J]. Neurology, 2004, 63(2): 359361[14] Ge sang L, Liu G, Gen W, et 2converting enzyme gene polymorphism and its association with essential hypertension in Tibetan population [J]. Hyertension Research, 2002, 25(3): 481[15] O Donnell CJ，L indpaintner K, Larson MG, et al. Evidence for association and genetic linkage of the angiotensinconverting enzyme locus with hypertension and blood pressure in men but not women in the Framingham Heart Study[J].Circulation, 1998,97（1）: 17661772[16]王吉耀，廖二元，：183184[17] 許貽白，王賢軍，諸金水，等. 血管緊張素I轉換酶基因多態(tài)性與急性腦血管疾病的關系[J]. 中華神經科雜志，1998，31（3）：152155第二部分 β2腎上腺素受體Arg16Gly和Gln27Glu基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和高血壓性腦出血的關聯(lián)研究EH是危害人類健康的主要疾病之一，是高血壓性腦出血的最主要的危險因素。EH的發(fā)病與交感神經張力增高有著重要關系，而β2腎上腺素受體是交感神經系統(tǒng)的重要組成部分，它主要通過改變血管緊張性、調節(jié)腎素釋放、影響水鹽代謝等途徑調節(jié)血壓，對血壓的短期和長期調節(jié)均有重要的影響。因此，β2腎上腺素受體相關基因成為高血壓的重要候選基因，是近年來人們關注和研究的熱點。本研究擬通過對EH和EH+CH患者的β2腎上腺素受體Arg16Gly和Gln27Glu基因多態(tài)性進行分析，以探討β2腎上腺素受體基因多態(tài)性與EH和EH+CH的關系，為EH和EH+CH的防治提供基礎研究資料。材 料 與 方 法1研究對象研究對象及分組：同第一部分。2 儀器和試劑主要儀器和設備及主要試劑及配制同第一部分。3試驗方法 標本采集及實驗室檢測：同第一部分。 β2AR基因提取、擴增 DNA的提取與鑒定：同第一部分。 PCR 擴增 DNA(1) 引物設計（上海生工合成） 參照 Volker Herrmann 的研究結果[1]，并與 GeneBank 核對。PCR引物序列（上海生工合成）Arg16等位基因引物序列：上游5’CTTCTTGCTGGCACCCAATA 3’Gly16等位基因引物序列：上游5’CTTCTTGCTGGCACCCAATG3’Gln27等位基因引物序列：上游5’GGACCACGACGTCACGCAGC3’Glu27等位基因引物序列：上游5’GGACCACGACGTCACGCAGG3’共同下游引物為：5’ACAATCCACACCATCAGAAT3’ 使用Eppendorf梯度PCR 擴增儀進行擴增。(2) 25ulPCR 反應體系：PCR反應體積25ul,包含無菌雙蒸水16 ul ,10,25mmol/ ul，,上下游引物﹙10mmol/L﹚ ul， ul，TaqDNA聚合酶﹙﹚ ul。：PCR反應條件為94℃ 預變性５min, 94℃變性45s,55℃退火50s,72℃延伸55s,共循環(huán)30周期，72℃最后一次延伸７min終止擴增。 PCR 擴增產物鑒定電泳分離：取 6ulPCR擴增產物與6，加樣于 2％瓊脂糖凝膠（含 1ug/ml 溴化乙錠），其中第一點樣孔加 D2000 ,擴增產物依次加樣后電泳，電壓為 160V，電泳時間 30min，在紫外線燈下及凝膠成像分析儀（UVP）下鑒定 PCR擴增產物電泳條帶。分別統(tǒng)計β2AR Arg16Gly、Gln27Glu基因PCR擴增產物電泳條帶：產物有475bp、442bp兩種片斷，在Arg1Gly各自泳道只出現(xiàn) 475bp者分別為 Arg/Arg、Gly/Gly 基因型(Arg1Gly16 純合子)，在兩泳道上都出現(xiàn)475bp者為Arg/ Gly基因型雜合子；在Gln2Glu各自泳道只出現(xiàn) 442bp者分別為Glu/Glu、Gln/Gln基因型(Glu2Gln27 純合子)，在兩泳道上都出現(xiàn)442bp者為Gln/Glu基因型雜合子。根據(jù)條帶，確定各基因型的具體例數(shù)，鑒定β2AR 多態(tài)性。4 統(tǒng)計學處理 通過凝膠電泳結果判讀個體基因型，計算各組樣本基因型頻率，等位基因頻率計算采用平衡法：A=AA+1/2AC；C=CC+1/2AC。 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)177。標準差表示（177。s），兩組間等位基因頻率和基因型的比較采用 χ2 檢驗，兩組間均數(shù)比較采用單因素方差分析， P 認為有極顯著性差異。以上資料統(tǒng)計學處理，在 軟件包中進行。結 果 1. EH組和EH+CH組及對照組的一般情況EH組和EH+CH組及對照組的一般情況詳見第一部分。2. β2AR 基因 Arg16Gly、Gln27Glu 多態(tài)性的電泳結果β2AR 基因 Arg16Gly、Gln27Glu 多態(tài)性的電泳結果見圖1。圖1 β2AR基因Arg16Gly 、Gln27Glu多態(tài)性分析：1 marker。2,3為Arg16Gly型雜合子；4，5為Gln27Glu型雜合子；6，7為 Arg16Arg型純合子； 8，9為 Gly16Gly型純合子；10，11為Gln27Gln型純合子；12，13為Glu 27Glu型純合子。FIG. 1 β2 AR gene Arg16Gly 、Gln27Glu polymorphism analysis: 1 marker。2,3: Arg16Gly heterozygote。 4，5 :Gln27Glu heterozygote。6,7: Arg16Arg homozygous。8,9: Gly16Gly homozygous。10,11: Gln27Gln homozygous。12,13Glu 27Glu homozygous.由圖1可見,β2AR 基因編碼的第16位點存在 Arg（A）→Gly（C）堿基突變，PCR 產物片段長度為 475bp,在瓊脂糖凝膠上電泳后表現(xiàn)為475bp條帶，在泳道只出現(xiàn) 475bp者分別為 Arg16Arg、Gly16Gly 基因型(Arg1Gly16 純合子)，在兩泳道上都出現(xiàn)475bp者為Arg16Gly基因型雜合子；β2AR 基因編碼的第27位點存在C→G堿基突變，導致Gln(27)→Glu ，PCR 產物片段長度為 442bp,在瓊脂糖凝膠上電泳后表現(xiàn)為442bp條帶，在泳道只出現(xiàn) 442bp者分別為Glu27Glu、Gln27Gln基因型(Glu2Gln27 純合子)，在兩泳道上都出現(xiàn)442bp者為Glu27Gln基因型雜合子。 3. EH和EH+CH患者β2 AR基因Arg16Gly基因型和等位基因頻率分布的變化EH和EH+CH患者β2AR基因Arg16Gly基因型和等位基因頻率分布的變化見表2，圖2，3。表2 β2AR16位點多態(tài)性的基因頻率和等位基因頻率分布（%）Tab2 Polymorphism of β2 AR (16 sites) gene and frequencies of the allele (%)組別n基因型頻率等位基因頻率Arg16ArgArg16GlyGly16GlyArgGly對照626 ()45 ()11 ()57 ()67()EH785 ()43 ()30 ()*53 ( )103 ()*EH+CH1148 ()62 ( )44 ()*78 ()150 ()*注：與對照組比較 *P由表2可見，與對照組比較，EH組和EH+CH組的Gly16Gly 基因型頻率均顯著增高，差異有顯著性（P），而Arg16Arg基因型頻率無顯著差異，EH組和EH+CH組間的Gly16Gly、Arg16Arg 和Arg16Gly基因型頻率比較亦無顯著性差異；與對照組比較，EH組和EH+CH組的Gly 等位基因頻率均顯著增高，差異有顯著性（P），EH組和EH+CH組間的Gly等位基因頻率比較亦無顯著性差異。0%20%40%60%80%100%EHEH+CHControlGly16GlyArg16GlyArg16Arg注：與對照組比較Gly16Gly基因型頻率P 圖2 β2 –AR基因Arg16Gly的基因型頻率比較Fig2 Comparison of genotype frequencies of β2 AR Arg16Gly gene0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%EHEH+CHControlGlyArg注：與對照組比較，Gly等位基因頻率P 圖3 β2AR基因Arg16Gly的Arg,Gly等位基因頻率比較 Fig3 Comparison of Arg，Gly allele frequency of β2 AR gene4. EH組和EH+CH組患者β2AR基因Gln27Glu 基因型和Gln、Glu等位基因頻率分布的變化EH組和EH+CH組患者β2AR基因Gln27Glu 基因型和Gln、Glu等位基因頻率分布的變化見表3，圖4，5。表3 β2 AR 27位點多態(tài)性的基因頻率和等位基因頻率分布（%）Tab3 Polymorphis