代謝型谷氨酸受體4亞型高通量藥物篩選模型的建doc(編輯修改稿)
2025-08-11 22:29 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 15的HEK293細(xì)胞株, 通過(guò)抗生素的篩選共得到68個(gè)重組細(xì)胞株。用500 mmol/L L Glu激活mGluR4, 從而引發(fā)內(nèi)鈣動(dòng)員, 進(jìn)而檢測(cè)鈣信號(hào)。其中, 檢測(cè)到32個(gè)克隆有明顯的鈣信號(hào), 但母細(xì)胞系HEK293/Ga15胞內(nèi)鈣離子水平?jīng)]有變化。最終挑選了1個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的克隆作為待定細(xì)胞株, 命名為mGluR4/HEK293/Ga15, 進(jìn)行擴(kuò)大及傳代培養(yǎng), 進(jìn)一步考察其特異性及穩(wěn)定性, 同時(shí)優(yōu)化其用于HTS時(shí)的篩選條件。 篩選條件的優(yōu)化某檢測(cè)方法是否適用于HTS, 具有嚴(yán)格的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn), 例如: 好的信躁比值, 高靈敏度以及一致 性[11]。為了評(píng)估在檢測(cè)系統(tǒng)中產(chǎn)生的信號(hào)的動(dòng)力學(xué)效應(yīng), 諸如熒光染料的孵育時(shí)間, 溶劑DMSO和NaOH的耐受性等鈣流檢測(cè)參數(shù)都被做了優(yōu)化。鈣熒光染料(Fluo3/AM)的孵育時(shí)間是影響鈣流檢測(cè)系統(tǒng)信躁比值的因素之一。為了在mGluR4/ HEK293/Ga15細(xì)胞株得到高的信躁比, 本研究首先優(yōu)化了鈣熒光染料的孵育時(shí)間。鈣熒光染料孵育時(shí)間越長(zhǎng), 就能得到越高的鈣流信號(hào)(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。在以下的試驗(yàn)當(dāng)中, 鈣熒光染料的時(shí)間被選定為90 min。為了評(píng)估由通用溶劑DMSO和NaOH引起的非特異性本底, DMSO 和NaOH耐受性通過(guò)鈣流檢測(cè)試驗(yàn)被測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明, % (圖1A)% (圖1B)時(shí), 對(duì)于在mGluR4/HEK293/Ga15細(xì)胞株上進(jìn)行鈣流檢測(cè)試驗(yàn)沒(méi)有顯著的影響。因此, 在后續(xù)試驗(yàn)中, %%。圖1 DMSO (A)和NaOH (B)耐受性檢測(cè)Fig. 1 DMSO (A) and NaOH (B) tolerance detection. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. mGluR4/HEK293/Ga15細(xì)胞株功能性檢測(cè)在以上優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下, 分別用不同濃度的mGluR4激動(dòng)劑 (LGlu、LAP4和 LSOP) 和拮抗劑(MSOP和 MPPG) 作用于mGluR4/HEK293/ Ga15細(xì)胞株, 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化, 以證實(shí)mGluR4篩選模型的功能活性。首先, 通過(guò)胞內(nèi)鈣流檢測(cè)試驗(yàn), 得到3種激動(dòng)劑(LGlu、LAP4和 LSOP)的劑量依賴效應(yīng)曲線。結(jié)果表明, 這3個(gè)激動(dòng)劑的半數(shù)有效刺激濃度(EC50)均與文獻(xiàn)報(bào)道相符(表1)。LAP4是最強(qiáng)的激動(dòng)劑, mmol/L(圖2)。 LSOP和LGlu次之, mmol/ mmol/L(圖2)。圖2 激動(dòng)劑對(duì)mGluR4細(xì)胞的劑量效應(yīng)Fig. 2 Dose response of agonist on mGluR4 cell line. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. Data points represent means 177。 SEM. EC50 value was determined using GraphPad Prism 5 software.另外, 通過(guò)鈣流檢測(cè)方法, 本研究測(cè)試了2個(gè)拮抗劑MSOP和 MPPG。用10 mmol/L的刺激劑LGlu刺激細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放, 同時(shí)用不同濃度的拮抗劑抑制此胞內(nèi)鈣的釋放, 從而得到拮抗劑的劑量依賴曲線(圖3), 并與文獻(xiàn)報(bào)道相符(表1)。MSOP和MPPG的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)分別是 mmol/ mmol/L (圖3)。 mGluR4/HEK293/Ga15細(xì)胞株穩(wěn)定性考察眾所周知, 有效性、特異性、可溶解性、穩(wěn)定性、毒性以及化合物和靶體之間的作用機(jī)制對(duì)于基于細(xì)胞水平的檢測(cè)方法至關(guān)重要。一旦靶體選定, 穩(wěn)定表達(dá)該靶體的細(xì)胞系就要被構(gòu)建并且在傳代培養(yǎng)時(shí)不被丟失。為了考察該mGluR4/HEK293/Ga15細(xì)胞株的穩(wěn)定性, mGluR4/HEK293/Ga15細(xì)胞在 60 mg/mL Zeocin的條件下培養(yǎng)至20代以上, 凍存 1代、5代、10代和20代細(xì)胞。之后同時(shí)檢測(cè)LGlu或MSOP在這幾代的mGluR4細(xì)胞上的作用。如圖4所示, 激動(dòng)劑LGlu的EC50 (圖4A, mmol/L~ mmol/L)和拮抗劑MSOP的IC50 (圖4B, mmol/L~ mmol/L)在不同代數(shù)細(xì)胞之間基本保持一致(表2)。由此可見, 該mGluR4/HEK293/ Ga15細(xì)胞株是穩(wěn)定的。表1 mGluR4激動(dòng)劑和拮抗劑作用活性總結(jié)(單位: mmol/L)Table 1 Potency of agonist and antagonist of mGluR4 (mmol/L)CategoryCompound nameReportedOur dataReferenceEC50IC50EC50IC50AgonistLGlu5~38//12, 13, 14, 15LAP4//16LSOP//8, 12, 13, 16, 17AntagonistMSOP//18MPPG/110/13圖3 拮抗劑對(duì)mGluR4細(xì)胞的劑量效應(yīng)Fig. 3 Dose response of antagonist on mGluR4 cell line. Agonist LGlu (10 mmol/L) was used to induce a calcium influx. For MPPG, final concentration of NaOH is %. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. Data points represent means 177。 SEM. IC50 value was determined using GraphPad Prism 5 software.表2 mGluR4激動(dòng)劑LGlu和拮抗劑MSOP作用于不同代細(xì)胞之間的活性總結(jié)(單位: mmol/L)Table 2 Potency of LGlu and MSOP at different passages of cells (mmol/L)PotencyP1P5P10P20LGluEC50MSOPIC50 Z’因子評(píng)估高質(zhì)量的檢測(cè)系統(tǒng)以及強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)分析為鑒定真正有活性的化合物提供了保證。Z’因子是一種被大眾所廣泛接受的既簡(jiǎn)便又實(shí)用的檢測(cè)系統(tǒng)評(píng)價(jià)參數(shù)[19,20]。Z’因子的大小介于 –∞ 和1之間。＜Z’＜1時(shí), 意味著此檢測(cè)系統(tǒng)是一個(gè)有效的系統(tǒng)。 當(dāng)0＜Z’＜, 意味著此檢測(cè)系統(tǒng)基本可行。 當(dāng)Z’=0時(shí),
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