代謝型谷氨酸受體4亞型高通量藥物篩選模型的建doc-wenkub.com
2025-07-12 22:29 本頁面
【正文】 REFERENCES[1] Tanabe Y, Masu M, Ishii T, et al. A family of metabotropic glutamate receptors. Neuron, 1992, 8: 169179.[2] Yang ZQ. Agonists and antagonists for group III metabotropic glutamate receptor 6, 7 and 8. Curr Top Med Chem, 2005, 5: 913918.[3] Kew JN, Kemp JA. Ionotropic and metabotropic glutamate receptor structure and pharmacology. Psychopharmacology (Berl), 2005, 179(1): 429.[4] Mathiesen JM, Svendsen N, Br228。最后, 74個化合物在96孔板上通過模擬篩選, 所有的陽性及陰性對照都得到了肯定的結果, 這些說明該mGluR4檢測系統(tǒng)可以非常靈敏的用于HTS, 從而鑒定mGluR4活性化合物。其次, 使用mGluR4特異性的激動劑/拮抗劑對mGluR4/HEK293/Ga15進行了驗證。 而HEK293/Ga15細胞中的Ga15可以將mGluR4偶聯(lián)到PLC通路上, 繼而可以通過檢測鈣流的變化來間接反應mGluR4的作用。與其他檢測方法相比, 通過熒光檢測胞內(nèi)鈣水平變化的方法來篩選GPCR的激動劑/拮抗劑靈敏度高、耗時短、使用范圍更廣泛、操作更簡便。從中也得到了一些對于該mGluR4有活性的化合物。本研究模擬了在96孔板上的篩選過程。在本次試驗當中, 圖4 mGluR4細胞株穩(wěn)定性檢測Fig. 4 Stability of mGluR4 cell line. Dose response curves of agonistLGlu (A) and antagonistMSOP (B) for passages 1, 5, 10 and 20 were showed. Agonist LGlu (10 mmol/L) was used to induce a calcium influx. The cell was tested up to passage 20. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. Data points represent means 177。＜Z’＜1時, 意味著此檢測系統(tǒng)是一個有效的系統(tǒng)。表1 mGluR4激動劑和拮抗劑作用活性總結(單位: mmol/L)Table 1 Potency of agonist and antagonist of mGluR4 (mmol/L)CategoryCompound nameReportedOur dataReferenceEC50IC50EC50IC50AgonistLGlu5~38//12, 13, 14, 15LAP4//16LSOP//8, 12, 13, 16, 17AntagonistMSOP//18MPPG/110/13圖3 拮抗劑對mGluR4細胞的劑量效應Fig. 3 Dose response of antagonist on mGluR4 cell line. Agonist LGlu (10 mmol/L) was used to induce a calcium influx. For MPPG, final concentration of NaOH is %. Assays were performed in duplicate and monitored with FlexStation plate reader. Data points represent means 177。為了考察該mGluR4/HEK293/Ga15細胞株的穩(wěn)定性, mGluR4/HEK293/Ga15細胞在 60 mg/mL Zeocin的條件下培養(yǎng)至20代以上, 凍存 1代、5代、10代和20代細胞。用10 mmol/L的刺激劑LGlu刺激細胞內(nèi)鈣的釋放, 同時用不同濃度的拮抗劑抑制此胞內(nèi)鈣的釋放, 從而得到拮抗劑的劑量依賴曲線(圖3), 并與文獻報道相符(表1)。LAP4是最強的激動劑, mmol/L(圖2)。因此, 在后續(xù)試驗中, %%。鈣熒光染料孵育時間越長, 就能得到越高的鈣流信號(數(shù)據(jù)沒有顯示)。 篩選條件的優(yōu)化某檢測方法是否適用于HTS, 具有嚴格的評判標準, 例如: 好的信躁比值, 高靈敏度以及一致 性[11]。Z’ 因子用下面公式計算:Z’ =13(|SD signal| + |SD background|)/(|Mean signal| |Mean background|)2 結果 陽性克隆篩選將人mGluR4重組質粒(mGluR4pcDNA4/TO)轉染穩(wěn)定表達Ga15的HEK293細胞株, 通過抗生素的篩選共得到68個重組細胞株。檢測拮抗劑活性時, 將激動劑LGlu和拮抗劑分別配制成10測試濃度, 并將其等體積混合成5測試濃度, 以25 mL/s的速度將25 mL的化合物加入到細胞中, 在加入化合物16 s之后采集鈣流數(shù)據(jù)直至120 s以上。 Matrix預先包被的96孔黑壁透明底板中(Cloning costar), 過夜培養(yǎng)于37oC、5% CO2溫箱。選擇具有明顯鈣流信號變化的細胞克隆(設定為P0代)傳代培養(yǎng), 并進行進一步的功能驗證。細胞貼壁生長24 h之后, 加入120 mg/mL Zeocin進行抗生素篩選。所得到的表達質粒命名為mGluR4 pcDNA4/To. 穩(wěn)定表達mGluR4細胞系構建穩(wěn)定表達Ga15蛋白的人胚腎細胞(HEK293/ Ga15)培養(yǎng)在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中, 置于37oC, 5% CO2溫箱中培養(yǎng)。 Probenecid (Sigma)。 MatriGel174。 FBS (Fetal Bovine Serum, Hyclone)。結果表明, 一個基于重組細胞水平的功能性檢測、適用于鑒定mGluR4激動劑/拮抗劑的HTS平臺被成功建立。大規(guī)模的藥物開發(fā)必不可少的要應用高通量篩選(High throughput screening, HTS)平臺, 這樣不僅可以節(jié)省人力、物力, 又可以大大縮短藥物研發(fā)前期所消耗的時間。神經(jīng)遞質傳遞的異常將會引起眾多的疾病。根據(jù)代謝型谷氨酸受體氨基酸系列同源性、信號轉導機制和藥理學特性, 將其分為3組: 第1組包括mGluR1和mGluR5, 能被3,5DHPG選擇性的激活, 它們被激活后, 使PLC活化, 促
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