【文章內容簡介】 在基線選擇2～8時觀察熒光強度（是否有三期特征）。并分別在Delta Rn 、Ct Number和 Rn 。 得出定量結果：調節(jié)基線和閾值以得到一較好的標準曲線。電腦據(jù)此曲線給出陽性結果值。此時應排除某些陰性標本因熒光曲線假性上揚而得出的假陽性結果和某些弱陽性標本因終末熒光值過低而顯示的假陰性。 發(fā)放報告：及時登記檢測結果記錄，發(fā)放臨床報告。：出現(xiàn)下述四種情況中的任何一種或多種，當次實驗結果不可發(fā)，查找原因，重做實驗。 陰性對照出現(xiàn)擴增。 陽性對照無擴增。 。 室內質控血清檢測結果出現(xiàn)失控情況，實驗失控的具體標準詳見室內質控標準操作程序。：達到下列要求后，當次實驗有效，可以發(fā)放結果。，陽性對照擴增。，斜率、截距和相關系數(shù)三個參數(shù)的數(shù)值均在范圍內。，具體標準詳見5. 本文涉及以下表格室間質評記錄表 PCR室內質控記錄表 室內質控圖 ABCD人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD3PR10版本/修訂號：A/0主題內容臨床標本的保存操作程序生效日期：20060808 第 22 頁 共91 頁臨床標本的保存操作程序1．目的：臨床標本正確保存，以便必要時復查。2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標本。3．負責人： 操作人： 4．程序：4．1 處理前的標本保存a）HBV：全血標本可4℃下短期（24h內）保存，長期保存則需分離出血清（血漿），保存于20℃下。d）HCV：在1小時內分離血清，吸取200181。l，加入20u Rnasin，保存于20℃。盡可能快的提取RNA。c）TB：痰或胸腹水、腦脊液、膿液標本用于TB檢測的短期保存可置于4℃下，長期保存則于20℃下。d）CT：標本短期（24h內）保存置于4℃下，長期保存則需在20℃下。4．2 報告發(fā)出后的標本保存：a） 提取的核酸標本當天檢測可置4℃保存，如當天不檢測應置20℃保存。報告發(fā)出后第二天丟棄。b） 原始血清/血漿樣本在報告發(fā)出后放入低溫冰箱20℃保存1個星期，以備復查。超過1個星期保存期的標本由室負責人酌情處理，一般按生物傳染性物品交醫(yī)院統(tǒng)一處理。c）血清/血漿標本放置低溫冰箱保存時須有記錄，按編號順序存放，并由專人負責管理。4．3 特殊標本的處理：對暫不檢測的項目和規(guī)定時間外收到的零散樣本，要隨時登記和交班，以免漏檢，遺失和延誤檢驗。對特殊樣本或特殊病人的樣本，實行“首接”負責制，所謂特殊樣本是指難于采集的樣本，以及特殊病人的樣本一律實行“首接”負責制，無論那位工作人員，一旦收到樣本后，均須負其責任，不得以任何借口推托，及時和正確保管和轉送樣本到有關實驗室或有關人員，同時作交班記錄和雙簽名。對于做長期病情動態(tài)考察的病人標本一律置于20℃下長期保存，使用時再按需取出檢測。5. 本文涉及以下圖表：PCR擴增接收標本記錄表 拒收標本記錄本 標本超低溫保存記錄表 ABCD人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD3PR11版本/修訂號：A/0主題內容臨床標本采集運送接收程序生效日期：20060808 第 24 頁 共91 頁臨床標本的采集、運送、接收程序1．目的：規(guī)范臨床待檢標本的正確采集、送檢和處理。2．適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標本。3．負責人： 操作人： 4．程序：4．1 標本的采集4．1．1 標本由臨床各科室接受過臨床基因擴增檢測有關標本采集、保存、運輸知識培訓的醫(yī)護人員采集并送至實驗室。4．1．2標本采集要求a）血液標本：，血標本采集后在2小時內送達實驗室（HCV采用EDTA抗凝的血漿）。離心（檢驗單與標本一道），編號。b）痰標本：用帶蓋的無菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰標本送檢。（對于無痰或少痰的患者，可用45℃加溫的100g/L NaCl水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出；對于小兒可以輕壓胸骨柄上方以誘導咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標本。）標本在室溫下保存不能超過24小時。c）生殖道拭子：尿道或陰道分泌物由醫(yī)生用專用取樣拭子（滅菌，一次性）采集樣本，及時送檢。采集生殖道拭子標本，要求男性病人在采樣前2小時內不能排尿，采樣時，將棉拭子伸入男性尿道及女性宮頸口2～3cm，轉動一周以獲得上皮細胞。d）尿液：由病人自留尿液于無菌封閉的杯中送檢。e）腦脊液和胸腹水：由臨床醫(yī)生采集后放入消毒的試管中及時送檢。注意：所有上述用于臨床標本采集的容器如試管或離心管，均應使用前高壓滅菌和密封。4．2 標本的運送標本采集后，密閉、標（貼）姓名，應盡可能快的送至檢測實驗室，如運送時間需2小時以上，必須用冰盒送至實驗室。標本中如加入了適當?shù)姆€(wěn)定劑，如用于RNA測定加入4mol/L異硫氰酸胍鹽（GITC）的血清（漿）標本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運送或郵寄。4．5 接收4．5．1嚴格對各類樣本的查對和雙簽制度，對病房各樣本及時進行驗收，查對，不符合要求的樣本一律退回，并有書面記錄。4．5．2 分類驗證4．5．2．1 一般內容進入實驗室的樣本在進行編號、離心前，工作人員應再次認真查對姓名，聯(lián)號，住院號，病區(qū)床號，項目等。對不符合要求者應作記錄，并及時通知采樣科室，正確及時地補采樣，以免延誤病人的檢測結果報告。對書寫不清楚的申請單，當事者要及時與病房聯(lián)系(可電話)，明確受檢者姓名，住院號，性別，年齡，病區(qū)，床號和檢驗項目等；并作相應記錄。4．5．2．2 按檢測項目驗證標本a）HBV：所需標本類型為未溶血的血清或血漿，注意血漿標本所用的抗凝劑，用EDTAK2，不可使用肝素。標本為全血時應及時分離出血漿保存。b）HCV：同上，但標本為血清時，要在1小時內分離出血清用于檢測。c）TB：晨起第一口深部痰(不能為唾液)、胸腹水、腦脊液、膿液或穿刺液。d）CT：尿道或陰道分泌物。4．5．2．3 實驗室人員對標本進行查驗，出現(xiàn)下表中不合要求的情況時，應拒收標本，登記并告知相關科室。類別拒收原因1未正確使用抗凝劑的標本造成凝血的標本2嚴重溶血3嚴重脂血4采血量不足（血清＜200uL、全血＜1mL） 5檢測項目TB的標本是唾液而不是晨痰6標本容器破裂，標本被污染7標本的病人姓名、年齡、性別等與檢驗單不相符8RNA檢測，采樣時間超過 2小時9其他可能嚴重影響檢驗結果的原因4．5．2．4 拒收程序a）對拒收的不合格標本應在拒收標本記錄本上登記。b）填寫不合格標本處置單，并隨同申請單送返送檢科室。c）必要時電話告之相關科室醫(yī)生或護士。5. 本文涉及以下圖表：PCR擴增接收標本記錄表 PCR擴增拒收標本記錄表 ABCD人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD3PR12版本/修訂號：A/0主題內容PCR生物安全防護措施生效日期：20060808 第 25 頁 共91 頁PCR生物安全防護措施1．目的：預防工作人員在實驗過程中被感染或污染。2．適用范圍：適用于本室所有工作人員。3．負責人： 操作人： 4．細則：4．1 實驗人員在實施生物防護措施時，應嚴格遵守各項相應的規(guī)章制度，建立起強烈的生物防護意識。4．2 每天更換廢液缸的2%戊二醛溶液，并保證2%戊二醛溶液用量為廢液缸內總液量的五分之一左右。配置消毒液時，正確量取足量的消毒劑（用量杯，保證濃度），水的用量也要正確，缸體密封性良好。4．3 實驗臺面日常清潔時使用75%的酒精擦拭。4．4 每區(qū)每次實驗后紫外燈照射30～60分鐘，如有需要可延長照射時間。4．5 所有來自病人的血液或體液標本均應視作傳染源，因此在標本的采集、運輸過程中，標本容器應完好無泄漏。4．6 處理標本時應穿工作服、戴手套，以免沾上皮膚。如手或其它部位的皮膚沾上血液或體液標本以及試劑，應立即沖洗干凈。有下列情況之一者，需另外消毒：手接觸有傳染性的微生物，水龍頭、水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量細菌污染。消毒劑可用“84”消毒液。4．7 在實驗過程中，病人標本（血液、體液）或試劑不慎濺入眼內應立即用清水洗。4．8 實驗過程中在使用針具等銳器時，盡量小心防止受傷。若被銳器刺破時，應立即脫下手套，盡量擠壓傷處，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要時進行預防補救措施。4．9 在實驗過程中病人標本（血液、體液）外漏時，應立即用2%戊二醛滴上，濾紙或紗布蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用紫外燈消毒。4．10 實驗完畢離開時，應脫下所有該實驗區(qū)個人防護裝備。4．11 實驗完畢后應對實驗室進行紫外消毒。4．12 遇有意外事故應立即報告科室負責人，當事人應立即注射相關疫苗或進行預防性治療，并進行醫(yī)學觀察，嚴重者應報告院技術負責人。5. 本文涉及以下表格紫外消毒車消毒記錄表 實驗室清潔消毒記錄表 ABCD人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD3PR13版本/修訂號：A/0主題內容PCR實驗室化學試劑配制程序生效日期：20060808 第 26 頁 共91 頁PCR實驗室化學試劑配制程序1．目的：保證實驗中用到的各種溶液符合實驗要求。2．適用范圍：核酸擴增熒光檢測實驗室常用溶液：4%NaOH溶液、75%酒精、消毒劑（三氯異氰尿酸或 二氯異氰尿酸鈉）、2%戊二醛溶液等。3．負責人： 操作人： 4．程序：4．4 化學試劑的配制：4．4．1 用具：干燥潔凈的250ml量桶一只，1000ml量桶一只，1000ml燒杯一只，三角燒瓶兩只，天平一架，100ml塑料試劑瓶、2000ml廣口瓶各一只。4．4．2 配制步驟：4．4．2．1 配制4%NaOH溶液:a）用天平稱取4克分析純的NaOH固體，置于一只三角燒瓶中。b）用250ml量桶準確取100ml水，緩緩注入盛放NaOH固體的三角燒瓶中。c）搖蕩三角燒瓶使NaOH固體充分溶解。d）然后緩緩傾倒入100ml塑料試劑瓶中密封保存?zhèn)溆谩?．4．2．2 配制消毒劑:a）一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯達到500mg/L，即可達到消毒作用。b）消毒劑為粉狀（20克/袋），如配制一升的消毒劑溶液，則取500g，倒入燒杯中，緩緩加入1000ml水充分溶解，備用。c）如需加大消毒力度，則有效氯濃度加大。4．4．2．3 配制75%酒精溶液:a）一般常規(guī)消毒的75%酒精由醫(yī)院藥劑科提供。b）RNA提取的75%酒精的配制，試劑盒提供DEPC水，酒精用分析純的無水酒精，根據(jù)當天的標本數(shù)量進行配制。4．4．2．4 配制2%戊二醛溶液:a）準確量取戊二醛原液20ml倒入1000ml燒杯中。b）量取980ml水，緩緩倒入1000ml燒杯中，混勻，加至2000ml廣口瓶中備用。注意事項：每份配制好的溶液保質期為14天 ABCD人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD3PR14版本/修訂號：A/0主題內容PCR實驗室記錄管理制度生效日期：20060808 第 28 頁 共91 頁PCR實驗室記錄管理制度目的：確保檢驗資料的記錄、保存狀態(tài)在控適用范圍：實驗過程中產生的數(shù)據(jù)、文本資料的記錄3．負責人： 操作人： 工作程序： 書面記錄文件的管理： 本實驗室的書面記錄包括：001 ABCD人民醫(yī)院檢驗科基因檢測實驗室平面圖編號ABCD/001002實驗室主要負責人簡歷表編號ABCD/002003PCR實驗室工作人員一覽表編號ABCD/003004PCR擴增接收標本記錄表編號ABCD/004005拒收標本記錄本編號ABCD/005006標本超低溫保存記錄表編號ABCD/006007PCR試劑購買記錄表編號ABCD/007008試劑驗收記錄表編號ABCD/008009PCR室特殊耗材驗收記錄表編號ABCD/009010普通耗材驗收記錄表編號ABCD/010011室間質評記錄表編號ABCD/011012PCR室內質控記錄表編號ABCD/012013室內質控圖編號ABCD/013014 PCR實驗室環(huán)境溫濕度記錄表編號ABCD/014015冰箱溫度質控圖