【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 半自動(dòng)化的形態(tài)學(xué)模板。 CASA 在評(píng)價(jià)精子活力、密度、形態(tài)方面 較人工方法具有兩個(gè)有點(diǎn)：高精確性和提供精子動(dòng)力學(xué)的量化數(shù)據(jù)（成熟細(xì)胞的特點(diǎn)：前向運(yùn)動(dòng)和高的活動(dòng)性）。 一些研究提示， CASA 對(duì)前向運(yùn)動(dòng)精子密度和活動(dòng)特征的評(píng)估結(jié)果與體外受精率和受精時(shí)間有很好的相關(guān)性 (Liu et al.,1991a。 Barratt et al., 1993。 Irvine et al., 1994。 Krause, 1995。 Donnelly et al., 998。Larsen et al., 2020。 Garrett et al., 2020。 Shibahara et al., 2020)。利用 CASA 來(lái)檢測(cè)精液活動(dòng)力和密度的方法分別在 和 小節(jié)中介紹，而 小節(jié)則闡述了計(jì)算機(jī)輔助形態(tài)學(xué)分析的相關(guān)問(wèn)題。 應(yīng)用 CASA 評(píng)價(jià)精子密度 CASA 儀器最好用于精子活力的分析，因?yàn)樗軌驒z測(cè)到活動(dòng)的細(xì)胞。活力百分比的估計(jì)值是不可信的，因?yàn)檫@個(gè)數(shù)值是在計(jì)算不活動(dòng)的精子數(shù)目的基礎(chǔ)上得出的，而一些顆粒碎片也可能被混淆其中。 現(xiàn)在已知很多因素都影響 CASA 儀器的使用，例如樣品的制備、讀數(shù)率、精子密度及計(jì)數(shù)池的深度 (Davis amp。 Katz, 1992。 Mortimer, 1994a, b。 Kraemer et al., 1998)。如果遵循正確的步驟，可得到可信的和可重復(fù)的結(jié)果 (Davis amp。 Katz, 1992)?？刹殚喪褂?CASA 參考指南。 用 CASA 分析精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)時(shí)，每個(gè)標(biāo)本中至少追蹤 200 個(gè)活動(dòng)精子。這將需要檢測(cè)更多數(shù)量的精子。如果想把精子按運(yùn)動(dòng)能力分類(lèi)或在一份標(biāo)本中做變異性的其它分析，至少需要追蹤 200 個(gè)，如果可能最好 400個(gè)活動(dòng)精子。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)力圖使每份標(biāo)本中被分析的精子數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)化。 CASA 儀器應(yīng)與可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析的計(jì)算機(jī)軟件結(jié)合起來(lái)。許 多運(yùn)動(dòng)參數(shù)的標(biāo)本分布是非正態(tài)分布的，因此提倡用中位數(shù)而不是用平均值去總結(jié)每個(gè)運(yùn)動(dòng)參數(shù)的中心趨勢(shì)。有必要在進(jìn)行一定統(tǒng)計(jì)學(xué)分析之前只對(duì)單一精子參數(shù)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換。 程序 每個(gè) CASA 設(shè)備的正確安裝對(duì)于維持設(shè)備良好的性能是至關(guān)重要的，并且有賴(lài)于預(yù)期的使用。制造商提供了適宜的參數(shù)，但使用者必須檢查每個(gè)設(shè)備的運(yùn)行是否達(dá)到其所要求的重復(fù)性和可靠性。必須使用適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制材料，如錄像磁帶（見(jiàn)附錄 7， ）以下作者已經(jīng)對(duì)一般情況下的 CASA 裝置進(jìn)行了討論 (Davis amp。 Katz, 1992。 Mortimer, 1994b。 ESHRE, 1998)。 標(biāo)本的制備 用于 CASA 的精液的采集和處理標(biāo)準(zhǔn)同第 2 章所述。 CASA 系統(tǒng)必須將樣本保持在 37℃，因?yàn)榫舆\(yùn)動(dòng)參數(shù)具有溫度敏感性。在精液未稀釋前檢測(cè)精子活動(dòng)特性和密度。檢測(cè)精子活動(dòng)力，標(biāo)本密度應(yīng)控制在 2 106/ml 到 50 106/ml 之間 (Garrett et al., 2020)。 具有高密度 (如高于 50 106/ml)精子的標(biāo)本，通常會(huì)增加碰撞的頻率，并可能由此出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。在這種情況下，建議稀釋標(biāo)本，而同源精漿更適合。 16,000g 離心一部分精液標(biāo)本， 6 分鐘，去除精漿。 用無(wú)精子的精漿稀釋原精液樣本至其密度低于 50 106/ml。 一次性 200181。m 深的計(jì)數(shù)池可以得到可靠的結(jié)果。這是一個(gè)雙池系統(tǒng)，兩個(gè)計(jì)數(shù)池均應(yīng)被充滿并檢測(cè)。必須檢測(cè)幾個(gè)有代表性的視野：每個(gè)計(jì)數(shù)板檢測(cè) 6 個(gè)視野（共 12 個(gè)視野）以得到可靠的結(jié)果。每個(gè)計(jì)數(shù)池至少應(yīng)該檢測(cè) 200 個(gè)精子。使用原理相同的質(zhì)量控制，使活動(dòng)力的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)化（見(jiàn) ）?？梢灾苯臃治鰳?biāo)本，也可以用錄像帶記錄方法。分析錄像（錄像帶、 CDROM 或 DVD）記錄的結(jié)果可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，并 按質(zhì)量保證程序進(jìn)行（見(jiàn)附錄 7， 小節(jié)）廠家將對(duì)錄像機(jī)的選擇以及使精子頭和背景產(chǎn)生最大反差的最適照明條件提出建議。 對(duì)于獲得精確結(jié)果所需的追蹤精子的時(shí)間目前尚有爭(zhēng)議。但追蹤精子的時(shí)間至少是 1 秒，足以得到基本 CASA 檢測(cè)精液的可靠結(jié)果 (Mortimer, 1994b)。 CASA 術(shù)語(yǔ) CASA 系統(tǒng)檢測(cè)的參數(shù)有一套標(biāo)準(zhǔn)的術(shù)語(yǔ)，說(shuō)明見(jiàn)圖 。 VCL=曲線速度 (181。m/s)。精子頭沿其實(shí)際的曲線，即在顯微鏡下見(jiàn)到的二維方式運(yùn)動(dòng)軌跡的平均速度。檢測(cè)細(xì)胞活力。 VSL=直線速度 (181。m/s)。根據(jù)精子頭在開(kāi)始檢測(cè)時(shí)的位置與最后所處位置之間的直線運(yùn)動(dòng)的時(shí)間平均速度。 VAP=平均路徑速度 (181。m/s)。精子頭沿其空間平均軌跡移動(dòng)的時(shí)間平均速度。這個(gè)軌跡是根據(jù) CASA 儀器中的算法對(duì)實(shí)際軌跡平整后計(jì)算出來(lái)的；這些算法因儀器不同而有所不同，故不同 CASA 系統(tǒng)的數(shù)值不能直接相比較。 ALH=精子頭側(cè)擺幅度 (181。m)。精子頭沿其空間平均軌跡側(cè)擺的幅度。以側(cè)擺的最大值或平均數(shù)值表示。不同的 CASA 儀器用不同的算法計(jì)算 ALH，故不同 CASA 系統(tǒng)的數(shù)值不能直接相比較。 LIN=直線性。曲線軌跡 的直線性。 VSL/VCL。 WOB=擺動(dòng)性。精子頭沿其實(shí)際軌跡的空間平均路徑擺動(dòng)的尺度。 VAP/VCL。 STR=前向性。空間平均路徑的直線性。 VSL/VAP。 BCF=鞭打頻率 (Hz)。精子曲線軌跡越過(guò)其平均路徑軌跡的時(shí)間平均速率。 MAD=平均移動(dòng)角度（度）。精子頭沿其曲線軌跡瞬間轉(zhuǎn)折角度的時(shí)間平均絕對(duì)值。 表 CASA 系統(tǒng)檢測(cè)變量的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ) 注：不同的 CASA 儀器用不同的數(shù)學(xué)運(yùn)算方法計(jì)算多項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)。目前所有儀器交叉測(cè)量結(jié)果的可比程度尚屬未知。 應(yīng)用 CASA 評(píng)估精子密度 應(yīng)用熒光 DNA 染色 CASA 可準(zhǔn)確檢測(cè)活動(dòng)精子的密度以及活動(dòng)力的百分比，但需謹(jǐn)慎應(yīng)用該技術(shù) (Garrett et al., 2020)。例如，如果使用一次性計(jì)數(shù)池，因?yàn)榫映錆M計(jì)數(shù)池時(shí)分布會(huì)不均勻，故評(píng)估不同位置的精子標(biāo)本是重要的 (DouglasHamilton et al., 2020b)。應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板驗(yàn)證是必要的。 可檢測(cè)的精子密度為 2 106/ml50 10６ /ml 之間 (Garrett et al., 2020)。精子密度在 50 10６ /ml 以上的需要稀釋?zhuān)?見(jiàn) 小節(jié)）。 注釋?zhuān)?CASA 儀器檢測(cè)并計(jì)數(shù)熒光染色精子的頭部。沒(méi)有顯微的評(píng)價(jià)就沒(méi)有其它方法知道精子是否完整（如頭尾相粘）。 計(jì)算機(jī)輔助精子形態(tài)學(xué)評(píng)估 圖像分析在評(píng)價(jià)精子形態(tài)方面，可能帶來(lái)量化、客觀性和可重復(fù)性的重大進(jìn)展。商業(yè)系統(tǒng)可用來(lái)量化精子頭部和中段的形態(tài)，主段精子也有可能。然而，精子尾部缺陷對(duì)運(yùn)動(dòng)的影響可以更直接地通過(guò)應(yīng)用 CASA 檢測(cè)活動(dòng)力和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。 CASA 系統(tǒng)通?？梢詫⒕宇^和中段分為正?；虍惓?，并且給出精子頭和中段、頭部橢圓和規(guī)則性以及依賴(lài)染色檢測(cè)的頂體區(qū)的平均值和標(biāo) 準(zhǔn)差或中位數(shù)。 與人工系統(tǒng)相比，自動(dòng)化系統(tǒng)更具客觀性，精確度和重復(fù)性的潛力 (Menkveld et al., 1990)。精確度和重復(fù)性不低于 7%(Garrett amp。 Baker, 1995)，這優(yōu)于有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員的手動(dòng)評(píng)估。計(jì)算機(jī)輔助精子形態(tài)學(xué)評(píng)估（ CASMA）結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性，因?yàn)榉椒ǖ牟灰恢?，比如焦距、照明、樣品制備和染色的不一致，可能存在諸多問(wèn)題 (Lacquet et al., 1996。 Menkveld et al., 1997)；正確的將精子頭與精液碎片區(qū)分開(kāi)存在技術(shù)上的困難，尤其在精子 濃度低時(shí) (Garrett Baker,1995； Menkveld et al., 1997。 Coetzee et al., 1999a, b)。自動(dòng)化評(píng)價(jià)的本質(zhì)意味著存在制備缺陷和人為影響時(shí)沒(méi)有補(bǔ)救方法。因背景底紋相對(duì)細(xì)胞染色的微小差異帶來(lái)的結(jié)果的偏差可導(dǎo)致錯(cuò)誤精子分類(lèi)或無(wú)法確認(rèn)精子細(xì)胞。 與人工形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)一樣，程序和儀器必須標(biāo)準(zhǔn)化及質(zhì)量控制，確保結(jié)果可比較、可信。精子可以按照 小節(jié)介紹的方式處理，以減少 CASMA 記錄背景的影響。如果精子密度低（ 2 106/ml），需要離心濃縮標(biāo)本，如 小節(jié)所述。 注意：離心可影響精子形態(tài)，采用必須記錄。 兩個(gè)研究已經(jīng)提示在 CASMA 結(jié)果與生育力之間存在顯著聯(lián)系。 Coetzee 等（ 1999c）發(fā)現(xiàn)自動(dòng)化的正常精子形態(tài)的結(jié)果可預(yù)測(cè)體外受精率和妊娠。 Garrett 等 (2020)發(fā)現(xiàn)精液中具有與透明帶結(jié)合（ Z%）的頭部形態(tài)特征的精子所占的百分比及直線速度（ VSL），與大樣本的低生育力夫婦的自然妊娠率是有顯著且獨(dú)立的關(guān)系。 Z%和 VSL 與生育力間的關(guān)系顯示是連續(xù)的，而且沒(méi)有提示妊娠率不再提高的界限值。很多大樣本生育力結(jié)果的研究要求精制 CASA應(yīng)用程序 以檢測(cè)精子形態(tài)。 自動(dòng)化系統(tǒng)可以為質(zhì)量控制系統(tǒng)提供數(shù)據(jù)，但是仍然需要更多的研究證明其臨床價(jià)值。 （沈陽(yáng)菁華醫(yī)院 許蓬譯） 第 4 章 研究精子功能所用檢測(cè)方法 當(dāng)實(shí)施精子功能檢驗(yàn)時(shí)，在射精 1 個(gè)小時(shí)之內(nèi)將精子從精漿中分離出去，以限制非精子細(xì)胞對(duì)精子的損害是至關(guān)重要的。隨著我們對(duì)調(diào)節(jié)精子功能分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的增加，將會(huì)發(fā)展更多新的診斷檢驗(yàn)方法。例如，近期的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)細(xì)胞核中 DNA 致密性和完整性在確定人類(lèi)精子功能活性方面的重要性。新出現(xiàn)的證據(jù)建議將精子 DNA 完整性及染色質(zhì)組織與生育力聯(lián)合起來(lái)考慮。 (Sakkas et al., 1998。 Aitken amp。 Krausz, 2020。 Virro et al., 2020)。 我們?cè)谛盘?hào)傳導(dǎo)路徑調(diào)節(jié)精子功能方面認(rèn)識(shí)的進(jìn)展，同樣也將促進(jìn)相關(guān)診斷性實(shí)驗(yàn)的發(fā)展，這在不育男性精子的檢測(cè)中是有缺陷的。為了更深入認(rèn)識(shí)男性不育的生物學(xué)本質(zhì)，已經(jīng)開(kāi)展了一組功能性試驗(yàn)，旨在評(píng)估人精子完成基本受孕過(guò)程的能力，如精子 卵子透明帶結(jié)合試驗(yàn)，頂體反應(yīng)試驗(yàn)以及與卵母細(xì)胞卵黃膜融合試驗(yàn)。 活性氧類(lèi)物質(zhì) 前言 中段帶有多殘留細(xì)胞質(zhì)的異常精子會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧類(lèi)物質(zhì) (ROS)，并且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在高活性的細(xì)胞質(zhì)酶，如肌酸磷酸激酶。 (Rao et al., 1989。 Gomez et al., 1996。 Aitken et al., 2020)。 活性氧類(lèi)物質(zhì)是氧的代謝產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫、氫氧根、過(guò)氧化氫根和一氧化氮。當(dāng)過(guò)量存在時(shí)，這些活性氧類(lèi)物質(zhì)通過(guò)誘發(fā)細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 DNA 的氧化損傷而造成病理性損害。 (Griveau amp。 Le Lannou, 1997。 Aitken et al., 2020。 Henkel et al., 2020)。許多細(xì)胞具有酶 性抗氧化劑系統(tǒng)（超氧化物岐化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化酶和過(guò)氧化氫酶）或非酶性抗氧化劑系統(tǒng)（尿酸、維生素 C、維生素 E）。當(dāng)這些防御機(jī)制受制時(shí)，精子功能將受到損傷。(Agarwal et al., 2020)。 在人類(lèi)射出的精液中，活性氧類(lèi)物質(zhì)是由精子 (Aitken amp。 Clarkson, 1987。 Alvarez et al., 1987。 Iwasaki amp。 Gagnon, 1992)和白細(xì)胞 (Aitken amp。 West, 1990)產(chǎn)生的。精漿中有抗氧化物清除劑和酶，某些男性的這些物質(zhì)可能不足 (Jones et al., 1979。 Smith et al., 1996)。在制備輔助受孕的精子時(shí)去除精漿（見(jiàn)第 5章），有可能使精子更易受到氧化損害。生成高濃度的 ROS 可能引起過(guò)氧化損害和精子功能喪失，也可能引起細(xì)胞核與線粒體基因組的 DNA 的損害 (Sawyer et al., 2020)。常用精子存活定量測(cè)定來(lái)評(píng)估人類(lèi)精子的質(zhì)量。這樣含量測(cè)定的結(jié)果與精子脂質(zhì)過(guò)氧化的狀態(tài)密切相關(guān)。 (Gomez et al., 1998) 應(yīng)用魯米諾或 lucigenin 作為探針的化學(xué)發(fā)光過(guò)程，可以檢測(cè)人精子產(chǎn)生 ROS 的量以及氧化還原劑的 活性。 精子懸液產(chǎn)生的活性氧類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定 原理 此程序需要使用一個(gè)靈敏的照度計(jì)來(lái)檢測(cè)存在化學(xué)發(fā)光探針，如魯米諾或 lucigenin 時(shí)精子產(chǎn)生的少量的光。這種方法是使用魯米諾和辣根過(guò)氧化物酶的混合物，從而能夠敏感地檢測(cè)到過(guò)氧化氫的產(chǎn)物。然而，也可以用其它探針（如 lucigenin）來(lái)檢測(cè)洗滌后的人精子產(chǎn)生的活性氧類(lèi)物質(zhì)（ ROS）（ Aitken et al., 1992。 McKinney et al., 1996）。 由于人精子表面沒(méi)有 FMLP 受體，由白細(xì)胞特異探針 formylmethionylleucylphenylalanine (FMLP)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)對(duì)白細(xì)胞群是特異的，并且可以用含有已知數(shù)量的多形核白細(xì)胞懸液校正。（見(jiàn)圖 ） 注釋 1：這些探針測(cè)定精子活力的精確性還是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題 (Aitken et al., 2020)，但是所得的數(shù)據(jù)反應(yīng)精子功能。 (Zorn et al., 2020。 Said et al., 2020) 注釋 2：白細(xì)胞產(chǎn)生活性氧類(lèi)物質(zhì)的能力至少是精子的 100倍。因此含少量的白細(xì)胞就會(huì)對(duì)精子懸液產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)產(chǎn)生重要影響。 試劑 1．不含酚紅的 Hank， s 平衡鹽溶液 (HBSS)：見(jiàn)附錄 4， A 小節(jié)。 2．不含酚紅的 KrebsRinger 培養(yǎng)液（ KRM）：見(jiàn)附錄 4， A 小節(jié)。 3． 25 mmol/l 魯米諾： 29 mg 魯米諾（ 5amino2,3dehy