【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 分析 RFLP 的使用者來(lái)說(shuō)，是非常實(shí)用的功能。 　 核酸引子設(shè)計(jì)　 Vector NTI 有引子設(shè)計(jì)的功能，用戶可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求，設(shè)計(jì)使用者所需 之特定核酸引子。首先在主程序中用戶將 PCR 反應(yīng)的區(qū)段序列用光標(biāo)選取，接 著進(jìn)入 Analyses→Primer Design(圖 )：圖 選取 PCR 反應(yīng)的區(qū)段，設(shè)計(jì)特定核酸引子 　 此項(xiàng)目可以提供用戶根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行引子設(shè)計(jì)。 可以將設(shè)計(jì)好的引 子進(jìn)行存取和分析，也可以將設(shè)計(jì)好的引子資料傳送 Invitrogen 進(jìn)行引子合成。 　 Find PCR Primers：進(jìn)入這個(gè)項(xiàng)目后用戶會(huì)先看到一個(gè)窗口(圖 )：圖 Find PCR Primers 窗口，要進(jìn)階設(shè)定，點(diǎn)選 More 　 使用者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求來(lái)設(shè)定相關(guān)的條件：上方 Region of Analysis 可以 填入欲分析的序列范圍；Product Length 可以設(shè)定使用者 PCR 所夾的序列長(zhǎng)度。 中間 Maximum Number of Output Options 可以設(shè)定引子組數(shù)， 下面的參數(shù)是可以設(shè) 計(jì)引子的特性，如 Tm 值及引子長(zhǎng)度等等。若要在引子兩端加入限制酶剪切序列 可以點(diǎn)選 ：圖 Find PCR Primers 進(jìn)階設(shè)定，在引子兩端可加入限制酶剪切序列 　 使用者可以在下方 Attach to 5’terminus(圖 )點(diǎn)選 加入欲設(shè)定的限制酶 即可；上方 UserDefined Primers 的項(xiàng)目可以把在 Local Database 中現(xiàn)有的引子資 料直接使用。以海大斑馬魚(yú)基因?yàn)槔樱O(shè)計(jì)一個(gè)兩端帶有 EcoRI 和 NdeI 的限 制酶片段、Tm 值介于 55 到 60、GC 含量介于 50 到 60、長(zhǎng)度介于 20 到 欲夾 的序列全長(zhǎng)及引子數(shù)目，設(shè)定好相關(guān)條件后按下確定(圖 )： ”確定” 　 這時(shí)用戶在文字窗口(圖 )的下方字段可以看到多出一個(gè) PCR Analysis 的文圖 文字窗口，增加了 PCR Analysis 的數(shù)據(jù) 件夾，上面會(huì)顯示用戶設(shè)計(jì)的引子數(shù)據(jù)： 　 在這個(gè)字段中使用者首先看到序列會(huì)被一個(gè)空格切成兩部分(圖 藍(lán)色部 分)，左邊的序列為使用者加入限制酶的序列；右邊的序列為設(shè)計(jì)的引子序列。 在每組的正向和反向引子下方會(huì)顯示序列的相關(guān)數(shù)據(jù)， 用戶想要儲(chǔ)存結(jié)果只要選 取引子，接著按下鼠標(biāo)右鍵：圖 選取序列字段后右鍵單擊，對(duì)引子進(jìn)行儲(chǔ)存動(dòng)作 　 使用者可以點(diǎn)選 Save To Database(圖 )：圖 儲(chǔ)存引子到數(shù)據(jù)庫(kù) 　 存取方式和前一章所介紹的作法是完全相同的，存盤的默認(rèn)路徑指向 Local Database 中的 Oligos 文件夾里 （如同前一章所介紹的方式， 使用者也可以在 Local Database 中建立屬于自己的引子檔案夾） 如果想要輸出序列， 。 可以點(diǎn)選 Copy Item Data 進(jìn)行輸出(圖 )： 　 若是直接訂購(gòu)引子，使用者可以點(diǎn)選 Order 的項(xiàng)目，這樣子引子的數(shù)據(jù)就會(huì) 送到 Invrogen 公司進(jìn)行引子合成服務(wù)。Add to Oligo List 功能和 Add to Gel Sample List 功能類似，一樣會(huì)把引子數(shù)據(jù)暫存在窗口中，以便于進(jìn)一步的分析。要開(kāi)啟 Oligo List 時(shí)，使用者只要點(diǎn)選 即可(圖 )： 圖 開(kāi)啟 Oligo List，對(duì)引子進(jìn)行編輯和分析 (圖 )。 　 使用者如果要進(jìn)一步分析引子的特性可以點(diǎn)選 Analyze 功能：圖 編輯與分析引子數(shù)據(jù) 　 如圖 所示，左手邊可以先設(shè)定分析的條件，接著按下 Analyze 右邊的字圖 左邊字段為設(shè)定分析的條件，右邊字段顯示分析的結(jié)果 段就會(huì)顯示分析的結(jié)果： 　 最右邊的窗口會(huì)顯示該引子回紋以及重復(fù)片段位置， 其分析的條件在左手邊 字段中的 Palindroms 以及 Nucl. Repeats 這兩個(gè)選項(xiàng)；使用者還可以點(diǎn)選 (圖 )：圖 分析 Dimers amp。 Hairpin Loops 的狀況 　 在這個(gè)窗口中， 實(shí)線數(shù)目的相關(guān)設(shè)定是在 Oligo Analysis 左邊字段下方的 Stem Length 項(xiàng)目（此數(shù)值關(guān)乎 dimer 跟 hairpin Loop 分析的嚴(yán)謹(jǐn)度，建議數(shù)值調(diào)高跟調(diào) 低的結(jié)果都進(jìn)行分析） 。 　 NOTE： 在做引子設(shè)計(jì)的時(shí)候盡量減少 dimer 和 hairpin Loop 的產(chǎn)生， 因?yàn)?dimer 和 hairpin Loop 會(huì)降低使用者 PCR 的效率。 　 用戶可以在分析的窗口窗口(圖 )進(jìn)行手動(dòng)編輯，只要打入序列就可以分 析使用者編輯的序列，但是請(qǐng)注意不可以有空格存在：圖 在右邊字段直接輸入序列，分析輸入的序列 　 使用者也可以把現(xiàn)有的引子序列， 利用鼠標(biāo)復(fù)制貼上的功能將序列貼進(jìn)來(lái)分 析。分析的結(jié)果可以點(diǎn)選 Save Results 儲(chǔ)存，在此建議引子設(shè)計(jì)完成后，可以在 分析的窗口進(jìn)行引子序列的修飾， 讓使用者的引子更接近所需要的條件以及降低 dimer 跟 hairpin Loop 形成的可能性。 　 使用者也可以在一開(kāi)始分析時(shí)，就把引子的設(shè)定條件做更細(xì)部的修訂，在一 開(kāi)始設(shè)定的字段中后面還有很多選項(xiàng)(圖 )：圖 在一開(kāi)始的分析時(shí)，做細(xì)部的字段 　 使用者可以根據(jù)自身的需求去設(shè)定這些項(xiàng)目，在引子條件設(shè)定完成后，可以 按左下方的 儲(chǔ)存，之后若要在相同條件下設(shè)計(jì)引子時(shí)，只要按下 就可以叫出預(yù)設(shè)的條件。 Amplify Selection：此功能和 Find PCR Primers 幾乎一樣，差別只是在于引子 的設(shè)計(jì)位置會(huì)落在用戶所選擇序列范圍端點(diǎn)跟端點(diǎn)的前后片段：圖 Amplify Selection 的設(shè)定 　 這個(gè)窗口(圖 )下使用者想要夾 400bp 到 800bp 的片段，引子的設(shè)計(jì)落點(diǎn) 會(huì)在這個(gè)范圍前后兩端，在 Before 跟 After 的選項(xiàng)用戶可以把引子的分析點(diǎn)從端 點(diǎn)的前后推進(jìn)來(lái)進(jìn)行分析（也可以不用設(shè)定，這樣子引子只會(huì)落在分析范圍的端 點(diǎn)內(nèi)） ，程序會(huì)分析出最佳的引子落點(diǎn)（大約涵蓋在端點(diǎn)序列前后部份） ，其他操 作方式和 Find PCR Primers 是相同的(圖 )。 ： 此功能和 Find PCR Primers 也是幾乎一樣， 但是分析的范圍設(shè)定 在使用者有畫(huà)在圖譜上面 Features 的部分，注意要執(zhí)行此功能時(shí)，用戶事先畫(huà)好 的 Features 名稱必須要和 提供的名稱一樣才能執(zhí)行。此功能操作接口和 Find 圖 Amplify Features 的設(shè)定 PCR Primers 一樣，只差了一個(gè) Features 的選項(xiàng)(圖 )： 　 用戶只要按下 Add 的按鈕把用戶畫(huà)在圖形上的 Features 加進(jìn)去，再按下確定 就可以分析出 Features 的引子序列了(圖 )：圖 使用 Amplify Features 分析的結(jié)果 ：也和 Find PCR Primers 功能幾乎相同，差異的地方 只是在于在中央間出現(xiàn) Sense Primers 和 Antisense Primers 選項(xiàng)，用戶可以把儲(chǔ)存 的引子檔案加入到設(shè)計(jì)的窗口(圖 )中：圖 將儲(chǔ)存的引子檔案加入設(shè)計(jì) 　 其他操作功能和 Find PCR Primers 都是一樣的。 Long PCR：這項(xiàng)功能將在分析 genomic DNA 再說(shuō)明。 Multiplex PCR List：和 Add to Oligo List 功能差不多，只是直接把欲分析引子的序 列加入暫存窗口內(nèi)進(jìn)行引子分析的功能(圖 )：圖 使用 Multiplex PCR List 分析的結(jié)果 ：此功能將在多重序列比對(duì)的部分再進(jìn)行說(shuō)明。 Sequencing Primers：這項(xiàng)功能可以幫用戶設(shè)計(jì)定序時(shí)所需的引子，在窗口 (圖 )中設(shè)定想要設(shè)計(jì)的條件：圖 幫助使用者設(shè)計(jì)定序時(shí)所需之引子 設(shè)好條件之后只要按 OK 就會(huì)顯示引子數(shù)據(jù)，后續(xù)操作方式和 Find PCR Primers 相同：圖 利用 Sequencing Primers 分析的結(jié)果 Hybridization Probes：此功能適用于設(shè)計(jì)核酸探針(圖 )，能夠用在南方墨 點(diǎn)、北方墨點(diǎn)及定位雜交等實(shí)驗(yàn)探針設(shè)計(jì)： ，可設(shè)計(jì)核酸探針 設(shè)定好條件后按下 OK 就會(huì)顯示探針數(shù)據(jù)， 后續(xù)操作方式和 Find PCR Primers 相同：圖 使用 Hybridization Probes，顯示探針數(shù)據(jù) NOTE：引子設(shè)計(jì)的條件和注意事項(xiàng)請(qǐng)參考相關(guān)的設(shè)定說(shuō)明。設(shè)計(jì)引子時(shí)多 嘗試不同的條件配合 NTI 軟件進(jìn)行分析，如此用戶較有機(jī)會(huì)得到最佳的引子。 (Basic Local Alignment Search Tool) 第九章　 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 　 Vector NTI BLAST 程序可以和 NCBI 的數(shù)據(jù)庫(kù)相通， 用戶只需透過(guò) NTI 的界面就可以進(jìn)行 BLAST 的功能，其搜尋結(jié)果和 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果完全相同。 　 用戶可以在 NTI 的附屬程序(圖 )下找到 BLAST Search：圖 使用附屬程序內(nèi)的 BLAST Search 工具 也可以從主程序上方 Tools 的項(xiàng)目進(jìn)入(圖 )：圖 使用 Vector NTI 主程序開(kāi)啟 BLAST Search 的功能 (圖 )，詢問(wèn)使用者欲連結(jié)至哪一個(gè)服務(wù)器進(jìn)行分析，使用 者只要點(diǎn)選上方的 NCBI BLAST Sever 就可以了，然后按下 OK 進(jìn)入 BLAST 程序：圖 跳出詢問(wèn)鏈接至服務(wù)器的窗口，選擇 NCBI BLAST Server 就可以 進(jìn)入 BLAST 程序之后用戶可以看見(jiàn)一個(gè)操作的窗口，大致上會(huì)被分成兩個(gè)區(qū)塊(圖 )： 上方的字段是輸入使用者欲分析的序列；下方的字段是可以顯示分析的結(jié)果。圖 進(jìn)入 BLAST 的程序，出現(xiàn)兩個(gè)區(qū)塊，上方區(qū)塊輸入序列，下方區(qū)塊為顯示分析結(jié)果 序列的輸入很簡(jiǎn)單，使用者只要把想要分析的序列復(fù)制貼上至此區(qū)塊就可以了(圖 )。圖 貼上欲分析的序列 (Basic Local Alignment Search Tool) 接下來(lái)要進(jìn)行 BLAST 相關(guān)的設(shè)定(圖 )：圖 BLAST 相關(guān)設(shè)定工具 首先使用者要先設(shè)定 Program(圖 )的項(xiàng)目：圖 BLAST 中的 Program 有 5 個(gè)項(xiàng)目，代表不同比對(duì)方式 　　　　　　　　 這 5 個(gè)項(xiàng)目(圖 )所代表的比對(duì)方式會(huì)有所不同： blastn 是指把欲分析的序列和 NCBI 的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)做比對(duì)，當(dāng)用戶欲分析的序列是 DNA 或者是 RNA 時(shí)適用此項(xiàng)目； blastp 是指將欲分析的序列去和 NCBI 的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)做比對(duì)，當(dāng)用戶欲分析胺基酸序列時(shí) 　 適用此項(xiàng)目； blastx 是指把使用者的核酸序列轉(zhuǎn)譯成胺基酸，再和 NCBI 的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（會(huì)有 六個(gè)不同的胺基酸序列，正股三個(gè)，反股三個(gè)。請(qǐng)參照轉(zhuǎn)譯功能中 6 Frame Translation 部分。； ） tblastn 是指將使用者的胺基酸序列反轉(zhuǎn)譯成為核酸序列后再去和 NCBI 的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)做比對(duì)，注 意這個(gè)項(xiàng)目之下會(huì)因 6 Frame Translation 的緣故出現(xiàn)六種不同的核酸序列。 Tblastx 的部分是指將使用者的核酸序列用 6 Frame Translation 進(jìn)行轉(zhuǎn)譯后的蛋白質(zhì)序列（總共有 六種不同序列）和 NCBI 的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 6 Frame Translation 后的 蛋白質(zhì)序列做比對(duì)。圖 五種不同的 BLAST 方法 (圖 )：圖 BLAST 為最常用的比對(duì)，PSIBLAST 為相同家族的比對(duì)，PHIBLAST 是與特定的胺基酸比對(duì) 　 BLAST 為一般最常用的設(shè)定；PSI 跟 PHI BLAST 是用在蛋白質(zhì)序列的特殊搜尋比對(duì)，PSIBLAST （Position Specific Iterated BLAST）可以幫使用者比對(duì)相同蛋白質(zhì)家族的胺基酸序列，PHIBLAST （Pattern Hit Initiated BLAST）可以就特定的胺基酸部分進(jìn)行比對(duì)；MEGABLAST 可以用在非常相似， 近乎完全相同的核酸序列搜尋， 也就是只比對(duì)接近百分之百的序列。 在最右邊有個(gè) Database 的項(xiàng)目可 以選擇，用戶可以根據(jù)不同的需求選擇不同數(shù)據(jù)庫(kù)。一般 BLAST 搜尋只要使用 nr 數(shù)據(jù)庫(kù)就可以了。 數(shù)據(jù)庫(kù)的說(shuō)明請(qǐng)見(jiàn)附錄。 下方還有項(xiàng)目(圖 ~12)可以針對(duì)使用者比對(duì)的需求進(jìn)行調(diào)整： 如果沒(méi)有特別的搜尋需求， 建議 Parameters 不需特別去更動(dòng)。圖 可以編輯比對(duì)的調(diào)整 圖 如有選擇 PSI、PHI 才能對(duì)其做調(diào)整 (Basic Local Alignment Search Tool) 圖 如有選擇 MEGABLAST 才能對(duì)其做調(diào)整 注意 PSI、PHI 和 MEGABLAST 的設(shè)定要在該項(xiàng)目之下才能進(jìn)行調(diào)整。所有的設(shè)定都決定好了之 后只要按下右上方的 就會(huì)開(kāi)始進(jìn)行分析，此時(shí)下方的字段就會(huì)出現(xiàn)分析的進(jìn)度，用戶可以 在同一個(gè) BLAST 程序下面進(jìn)行多重分析(圖 )，當(dāng)需要進(jìn)行多次 BLAST 分析時(shí)，就不需要重復(fù)開(kāi) 啟 NCBI 網(wǎng)頁(yè)：圖 在同一個(gè) BLAST，可進(jìn)行多次 BLAST 分析 當(dāng)分析結(jié)束后 Status 會(huì)顯示 Finished(圖 )，此時(shí)就可以點(diǎn)選分析結(jié)果，本章范例是同時(shí)將核酸 序列以 和 MEGABLAST 進(jìn)行比對(duì)，在 Hit count 項(xiàng)目會(huì)顯示比對(duì)到的序列數(shù)目：圖 在 Hit Count 中顯示出比對(duì)到的數(shù)目 用戶分析的結(jié)果可以儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)中，只要打開(kāi)左上方的 Search 項(xiàng)目就可以進(jìn)行儲(chǔ)存，日后 BLAST 的結(jié)果可以直接打開(kāi)，不需要再重新操作 BLAST 進(jìn)行比對(duì)。 把 BLAST 分析的項(xiàng)目點(diǎn)選打開(kāi)后會(huì)出現(xiàn)類似主程序的畫(huà)面(圖 )：圖 直接打開(kāi)之前 BLAST 分析的檔案，不需重新再次操作 BLAST ，分割成三個(gè)窗口，上面偏左的文件夾是文字?jǐn)⑹龅拇翱?圖 )，提供使 用者 BLAST 搜尋的設(shè)定條件和比對(duì)到的數(shù)據(jù)，用戶可以打開(kāi)這些文件夾獲得更進(jìn)一步的信息：圖 文字窗口，提供用戶設(shè)定條件與比對(duì)到的數(shù)據(jù) 用戶可以點(diǎn)選畫(huà)藍(lán)色底線的選項(xiàng)(圖 )，就會(huì)自動(dòng)連上 NCBI 把相關(guān)的數(shù)據(jù)截取加載主程序中：圖 選擇藍(lán)色底線的部份，將直接連到 NCB