【文章內(nèi)容簡介】 Transcriptase MMLV、DL2000 DNA Marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒等均購自Takara公司（大連）； 氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、卡那霉素（Kanamycin Monosulfate，Kan）、利福平（Rifampicin，Rif）、潮霉素（Hygromycin，Hyp）等抗生素均購自Amerisco公司（）； 其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。 實(shí)驗(yàn)儀器BioRad MyCycler梯度PCR儀；Lightcycler 480羅氏熒光定量PCR；Sigma臺式高速離心機(jī)；Eppendorf CENTRIFUGE 5430R高速冷凍離心機(jī)；Amersham電泳設(shè)備；SHIMADZU UVmini 1240紫外分光光度計(jì)；自動型高溫滅菌鍋；80 ℃超低溫冰箱；振蕩培養(yǎng)箱；哈東聯(lián)紫外超凈工作臺；pH1211 pH計(jì)；水浴鍋；；恒溫金屬?。籘hermo微量移液器等其他常規(guī)儀器等。 實(shí)驗(yàn)方法 材料培養(yǎng)大腸桿菌以LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，添加相應(yīng)抗生素后進(jìn)行轉(zhuǎn)化株系的篩選。農(nóng)桿菌菌以YEB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，添加相應(yīng)抗生素后進(jìn)行轉(zhuǎn)化株系的篩選。在MS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因擬南芥，添加相應(yīng)的抗生素后進(jìn)行篩選。 材料處理將同時期收獲的經(jīng)過在4℃條件下處理24d打破休眠的野生型和過表達(dá)種子（每種約150粒），點(diǎn)種于無菌1/2MS固體培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)箱 (22 ℃，14 h/10 h光周期) 垂直生長，分別測定0、123460、78108h的種子的萌發(fā)率。取同時期收獲的經(jīng)過在4℃條件下處理24d打破休眠的野生型和過表達(dá)種子，點(diǎn)種于無菌1/2MS，光照培養(yǎng)箱 (22 ℃，14 h/10 h光周期) 垂直生長約3d，挑選生長一致的幼苗，移到另外無菌的1/2 MS培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)箱 (22 ℃，14 h/10 h光周期) 垂直生長10 d，每天記錄擬南芥的側(cè)根數(shù)量，測定最長側(cè)根和主根長度。將同時期收獲的經(jīng)過在4℃條件下處理24d打破休眠的野生型和過表達(dá)種子（每種約150粒），點(diǎn)種于含有不同濃度的ABA（0、5和10μmol/L）的無菌1/2 MS固體培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)箱 中(22 ℃，14 h/10 h光周期) 垂直生長，分別測定0、123460、784和108h的種子的萌發(fā)率。取同時期收獲的經(jīng)過在4℃條件下處理24d打破休眠的野生型和過表達(dá)種子，點(diǎn)種于無菌1/2MS，光照培養(yǎng)箱 (22 ℃，14 h/10 h光周期) 垂直生長約3 d，挑選生長一致的幼苗，移到含有不同ABA濃度（0、5和10μmol/L）無菌1/2MS固體培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)箱 (22 ℃，14 h/10 h光周期) 垂直生長10d，每天記錄擬南芥的側(cè)根數(shù)量主根長度。 每個試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)設(shè)置三個重復(fù)。 培養(yǎng)基的配置MS 培養(yǎng)基： g/L，蔗糖 30 g/L，瓊脂 1 %，pH ，121℃高壓滅菌20min，后倒平板。LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH ，滅菌鍋中121℃高壓滅菌20 min。YEB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 1 g/L，蔗糖 5 g/L，MgSO47H2O g/L，pH ，裝瓶后在滅菌鍋中121℃高壓滅菌20 min?；?，鋪板，37 ℃倒置培養(yǎng)10~16 h后觀察結(jié)果。 重組質(zhì)粒的鑒定 提取質(zhì)粒：使用質(zhì)粒小量抽提試劑回收目的條帶（參見Takara試劑盒說明書） PCR鑒定：以質(zhì)粒DNA為模板，按相應(yīng)的PCR體系與程序進(jìn)行PCR鑒定，以無菌ddH2O為模板作為陰性對照。 酶切鑒定：取質(zhì)粒DNA 4 μL和2 μL緩沖液，在20 μL的反應(yīng)體系中于37 ℃酶切反應(yīng)30min，電泳檢測酶切效果。 根癌農(nóng)桿菌（GV3101）感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 活化80℃超低溫保存根癌農(nóng)桿菌（GV3101）接種于3 mL YEB液體培養(yǎng)基中（含50mg/L Rif），28 ℃振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)過夜?；罨笕?00 μL菌液加入到50 mLYEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃（4 ℃，5000 rpm）離心5 min，收集菌體，放于10 mol/L NaCl溶液懸浮，冰浴片刻，4 ℃，5000 rpm離心5 min。取1 mL預(yù)冷的20 mmol/L CaCl2重懸菌體，分裝成每管200 μL，液氮中速凍1 min，置80 ℃保存?zhèn)溆谩?花芽浸蘸法轉(zhuǎn)化擬南芥及陽性植株的篩選正常條件下培養(yǎng)的擬南芥，在抽薹45 cm時剪去頂端花序，使腋生花序生長，約45 d后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前去除已經(jīng)開放及露白的花蕾，同時剪去角果。將擬南芥整株與花盆一起倒扣在菌液中浸苗35 min，轉(zhuǎn)化完畢后取出花盆，側(cè)放于托盤中，避光培養(yǎng)24 h后，直立放置花盆，進(jìn)行正常的光照培養(yǎng)。收取已成熟的T1代種子，點(diǎn)播在含50 mg/L Hyg的MS培養(yǎng)基中，4 ℃處理3 d后移入光照培養(yǎng)箱。810 d后挑選轉(zhuǎn)化體，將苗移入土中培養(yǎng)，以收獲T2代種子。將T2代種子繼續(xù)種于含有Hyg的MS選擇培養(yǎng)基上，選擇接近3:1分離群體的抗性植株，種植收獲T3。若T3代種子在選擇性培養(yǎng)基中全部具抗性，則對應(yīng)的T3代種子便是純合體。提取其葉片RNA，用基因的特異引物進(jìn)行RTPCR檢測。 氣孔開度測定取生長良好的45周齡擬南芥植株完全展開的蓮座葉，光下（光強(qiáng)200μmol/m2/s）60 min 誘導(dǎo)氣孔張開。取葉片下表皮，去除葉肉細(xì)胞，放置于含有ABA處理的MES溶液中，在光下（光強(qiáng)200μmol/m2/s）處理60 min，放置于顯微鏡下，隨機(jī)取3個視野測量，再在每個視野中隨機(jī)選取10個氣孔，用顯微測微尺測量記錄氣孔孔徑。 實(shí)時定量PCRCTAB法提取處理后的葡萄總RNA，MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈作為模板。Realtime PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 60 sec，95 ℃ 10 sec，56 ℃ 20 sec，72 ℃ 15 sec，40個循環(huán)；Melt曲線從72 ℃至99 ℃，第1步維持45 sec，以后每升高1 ℃維持5 sec。每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)。以ACTIN為內(nèi)參對基因進(jìn)行相對定量，Realtime PCR引物。定量實(shí)驗(yàn)所用引物如表1所示。表1 Realtime PCR引物基因名稱引物序列VvWRKY13FP: CGACTCGTTTCTTTACGCRP: AGTGAGGTGGATGTTCTTGVvactinFP: AATGAGAGATGGCTGGAAGAGRP: TACGAGCAAGAGCTGGAAAAtABA1FP: TATGAAGGTGATCTGCTTGTGGRP: CGTGTAACAAGTGTAGCCTGAAtABA2FP: TGGAGGAGCCACAGGGATARP: TTGGACTCACCACGAAGCAAtABI1FP: GCCTTTGTATGGTTTTACTTCGRP: GGATCAAACCGACCATCTAACAtABI3FP: AGCCAGAGTTCCTTCCTTTARP: TTGGTACGGATTCATGTTGT2 結(jié)果與分析 葡萄WKRY13的異源表達(dá)植株的獲得 pSuper1300WRKY13重組質(zhì)粒的構(gòu)建 bp20001000750500250100S1S2M pSuper1300WRKY13重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定圖1 pSuper1300WRKY13重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定 of PCR products of rebinant plasmids of pSuper1300WRKY13 注：M：DL 2000 DNA Marker； S1和S2：兩個樣品 將雙酶切得到的WRKY13片段回收，分別與同樣雙酶切回收的Super1300載體連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，挑取單菌落PCR鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到大小約700 bp左右的片段（圖1），說明樣品中包含帶有目的片段WRKY13的重組質(zhì)粒。 pSuper1300WRKY13重組質(zhì)粒的酶切鑒定 S1bp20001000750500250100M 圖2 pSuper1300WRKY13重組質(zhì)粒酶切鑒定 Analysis restriction digestion analysis of rebinant plasmids of pSuper1300WRKY13注：M：DL 2000 DNA Marker； S1和S2：兩個樣品 選取陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，片段大小一致，測序正確（圖2）。 pSuper1300WKRY13重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定 bp20001000750500250100S2MS1圖3 pSuper1300WRKY13重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌GV3101菌落 PCR鑒定 of PCR products of rebinant plasmids of pSuper1300WRKY13注：M：DL 2000 DNA Marker； S1和S2：兩個樣品 將正確的pSuper1300WKRY13重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取單菌落，進(jìn)行PCR鑒定，顯示片段大小正確（圖3），說明菌落包含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。 轉(zhuǎn)基因植株的篩選 圖4轉(zhuǎn)基因植株在抗性MS培養(yǎng)基上的生長情況 The growth of transgenic plants on MSHyp 利用花芽浸蘸法轉(zhuǎn)化擬南芥，收獲T0代種子，用50 mg/L的Hyp對轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進(jìn)行篩選，觀測轉(zhuǎn)基因植株在抗性MS培養(yǎng)基上的生長情況（圖4），挑選生長狀態(tài)良好，根系發(fā)達(dá)的幼苗移苗培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)鑒定。 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定bp20001000750500250100S1 S2