【文章內(nèi)容簡介】 蘿卜素，如八氫番茄紅素、番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)等。這些類胡蘿卜素已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥領(lǐng)域。（2） 生產(chǎn)高營養(yǎng)藻粉杜氏鹽藻干粉富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪酸，以及豐富的類胡蘿卜素，無難消化的細(xì)胞壁，因而是優(yōu)質(zhì)的家禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。杜氏鹽藻干粉含40%左右的蛋白質(zhì)，且蛋白質(zhì)的氨基酸組成與大豆相似富含賴氨酸，僅含少量的半胱氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和色氨酸。與其他單細(xì)胞來源(如酵母和細(xì)菌)的蛋白粉相比，杜氏鹽藻干粉中的核酸 (DNA和RNA)含量很低。由于核酸有毒副作用，因此這也是杜氏鹽藻干粉受市場歡迎的一個(gè)重要原因。（3）生產(chǎn)甘油和生物制品甘油是一種重要的商業(yè)有機(jī)化合物和滲透調(diào)節(jié)物，被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域。目前甘油的主要來源是石油，隨著石油資源的日益減少， 開發(fā)新的甘油來源具有重要的戰(zhàn)略意義。杜氏鹽藻富含甘油，在特定養(yǎng)殖條件下， 其含量可達(dá)干重的50%， 因此是甘油生產(chǎn)的潛在資源。除甘油外， 杜氏藻還是大規(guī)模生產(chǎn)其他重要生物制品的潛在物種，由于杜氏藻易培養(yǎng)、不易污染、外源蛋白的表達(dá)與純化方便，使得生產(chǎn)外源蛋白的成本明顯低于其他系統(tǒng)(如大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等)，作為一種新型生物反應(yīng)器，已呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。（4）提高植物耐鹽性杜氏藻是已知真核生物中最耐鹽的生物，能在35%飽和鹽溶液中生存。其耐鹽機(jī)制被認(rèn)為是通過調(diào)節(jié)自身細(xì)胞內(nèi)甘油濃度來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)杜氏藻在高鹽環(huán)境中生長時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的甘油含量將超過50%，以此補(bǔ)償細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差，同時(shí)為酶提供“合適的溶質(zhì)”以防止酶失活或受到抑制。但杜氏藻的耐鹽機(jī)制十分復(fù)雜，到目前為止遠(yuǎn)未完全清楚，有待進(jìn)一步研究。杜氏藻耐鹽機(jī)制的闡明及耐鹽基因的克隆，將對(duì)提高高等植物的耐鹽性、擴(kuò)大和提高農(nóng)作物的種植范圍和產(chǎn)量、緩解世界糧食危機(jī)，具有不可估量的意義。（5）廢水處理廢水處理包括3個(gè)層次：初級(jí)處理、二級(jí)處理和三級(jí)處理。其中二級(jí)處理是利用微生物對(duì)各種有機(jī)物進(jìn)行生物降解。在此階段，杜氏藻與其他微生物共生， 可促進(jìn)微生物的生長，同時(shí)杜氏藻消耗微生物分解產(chǎn)生的氮、磷和CO2等無機(jī)物，提供微生物需要的O2。研究顯示，特氏杜氏藻中的金屬結(jié)合肽和植物螯合肽可將無機(jī)砷代謝成砷聚合物，從而達(dá)到去除環(huán)境中重金屬的目的。（6）環(huán)境指示相對(duì)其他測試生物(如動(dòng)物)而言，藻類對(duì)生活污水或工業(yè)廢水有更高的敏感性。利用藻類來指示環(huán)境毒性的研究，最近有很多報(bào)道。Santin Montanya等報(bào)道了七種微藻對(duì)海洋環(huán)境殺蟲劑的測試方法，指出普氏杜氏藻是禾草滅、稀禾定、苯嗪草酮、二氯吡啶酸等殺蟲劑的最佳指示劑。黃小娟等[24]利用杜氏藻生長阻礙實(shí)驗(yàn)，測定排放到環(huán)境中特別是飲用水中的有機(jī)毒物，從而得知被測化合物的生物毒性。這種行之有效的測試飲用水污染的方法，在水質(zhì)污染監(jiān)測和控制方面有著廣闊的應(yīng)用前景 外源激素水楊酸與杜氏鹽藻的β胡蘿卜積累 水楊酸的性質(zhì)1976英國的Edmund stone首先發(fā)現(xiàn)柳枝皮可以治療瘧疾和鎮(zhèn)痛解熱，1828年德國John Buchner從柳樹皮中分離出少量的水楊苷（Salicin）1838年P(guān)iria將柳樹皮中這種活躍的有效成分命名為水楊酸( Salicylic Acid，簡稱SA)；1874年首次合成水楊酸，水楊酸的化學(xué)名稱為鄰羥基苯甲酸。水楊酸是一種植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡單酚類化合物，廣泛存在于高等植物中。純品是一種帶狀態(tài)結(jié)晶或輕質(zhì)的結(jié)晶性粉末，化學(xué)式為C6H4(OH)(COOH)。水楊酸易溶于乙醇、乙醚、氯仿、苯、丙酮、松節(jié)油，不易溶于水，20℃。水楊酸在植物界中普遍存在，一般較多分布在產(chǎn)熱植物的花序。據(jù)報(bào)道，水稻、大麥等34種主要農(nóng)作物的葉片和繁殖器官中都含有水楊酸，在不同植物及同一植物的不同組織內(nèi)含有的水楊酸的含量不同，通常含量較低，在產(chǎn)熱植物花序和受病原物侵染的植物中組織中含量較高。水楊酸是肉桂酸的衍生物，在植物體內(nèi)合成，一般認(rèn)為是通過莽草酸先形成肉桂酸，然后經(jīng)過兩條途徑生成水楊酸：一種是肉桂酸先經(jīng)過β氧化產(chǎn)生苯甲酸，在經(jīng)過羥化即產(chǎn)生水楊酸；另一種是肉桂酸先經(jīng)過羥基化產(chǎn)生鄰香豆酸，再經(jīng)β氧化產(chǎn)生水楊酸。 水楊酸的生理作用（1）抗病作用水楊酸在植物抗病性中的作用是目前研究最深入的，水楊酸在植物的抗病反應(yīng)中主要起信號(hào)分子的作用，是植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)(HR)和系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)所必需的物質(zhì)。1979年White首先發(fā)現(xiàn)外源水楊酸及其衍生物乙酰水楊酸處理煙草可誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的合成和對(duì)煙草花葉病毒的抗性。以后的研究進(jìn)一步表明，外源SA可誘導(dǎo)番茄、黃瓜、水稻、大蒜、大豆、甜菜、擬南芥等植物對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒等病原菌的抗性。水楊酸誘抗作用的發(fā)現(xiàn)為今后研制新型誘抗劑，減少有害農(nóng)藥的使用提供了新的思路和途徑，因而倍受人們的關(guān)注。（2）誘導(dǎo)開花1965年Lee和Skoog發(fā)現(xiàn)SA可誘導(dǎo)煙草組培植株開花，1974年Cleland和Ajami 鑒定誘導(dǎo)短日植物開花的物質(zhì)是水楊酸；外施水楊酸于浮萍科植物可誘導(dǎo)或促進(jìn)開花。水楊酸與蔗糖混合施用可促進(jìn)文心蘭開花，水楊酸、赤霉素和β萘酚誘導(dǎo)短日植物鳳仙花在長日照下形成花芽。現(xiàn)在對(duì)水楊酸誘導(dǎo)植物開花的機(jī)理仍不十分清楚, 有一種假說認(rèn)為是水楊酸起螫合劑作用[ 25]。（3）提高植物抗環(huán)境脅迫能力近年來的研究表明，水楊酸在植物抗冷、熱、干旱、鹽、臭氧、重金屬等環(huán)境脅迫方面有明顯的作用。在馬鈴薯等產(chǎn)熱植物上，水楊酸可促進(jìn)線粒體交替呼吸途徑，增加產(chǎn)熱量，提高馬鈴薯的抗冷性。Yalpani等發(fā)現(xiàn)煙草受到熱脅迫時(shí)其內(nèi)源SA水平升高。%的NaCl脅迫下，、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，提高幼苗體內(nèi)SOD、CAT等細(xì)胞保護(hù)酶的活性，抑制了MDA的積累，提高了小麥幼苗葉片對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性。有人提出，在鹽脅迫條件下，外源SA能夠顯著提高Na+向下運(yùn)輸?shù)倪x擇性而增強(qiáng)K+向上運(yùn)輸?shù)倪x擇性,因此,能顯著提高植物體的抗鹽性。此外,SA還與臭氧、重金屬脅迫等有關(guān)。（4）生熱效應(yīng)天南星科植物佛焰花序的生熱現(xiàn)象很早就被認(rèn)識(shí)到了，直到1987年Raskin 等試驗(yàn)證明，引起生熱的物質(zhì)就是水楊酸。正如Voodoo百合雄花的提取液一樣，外源施用SA也可以使成熟花上部佛焰花序的溫度提高。SA能夠產(chǎn)熱的原因被認(rèn)為是由于其可增加植物抗氰呼吸，抗氰呼吸電子傳遞系統(tǒng)產(chǎn)生的能量多以熱的形式釋放出來，而不主要合成化學(xué)能；用抗氰呼吸抑制劑處理，放熱就減少；SA對(duì)非產(chǎn)熱植物的抗氰呼吸也有誘導(dǎo)作用。 水楊酸的應(yīng)用1763 年英國的Edmund Stone首先發(fā)現(xiàn)柳樹皮有很強(qiáng)的收斂作用，可以治療瘧疾和發(fā)燒，后來研究證明水楊酸在植物界普遍存在，作為一種植物內(nèi)源信號(hào)分子，對(duì)植物的許多生理過程如植物開花、產(chǎn)熱、種子發(fā)芽、氣孔關(guān)閉、膜通透性及離子的吸收等起調(diào)控作用，一些科學(xué)家認(rèn)為應(yīng)該將之作為一種新的植物激素來看待。有關(guān)水楊酸與植物抗逆的研究始于20世紀(jì)70年代，研究發(fā)現(xiàn)：SA與植物抗病之間存在著莫大的關(guān)聯(lián)，SA應(yīng)用于植物抗生物脅迫的研究逐漸成為植物抗逆性研究的熱點(diǎn)。近十多年來，關(guān)于SA對(duì)植物抗病性的誘導(dǎo)及其作用機(jī)制、SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面的研究也已取得重大進(jìn)展。此外，SA用于植物抵抗非生物脅迫(重金屬、臭氧、紫外輻射、高溫、低溫、干旱、鹽漬等逆境)的研究也開始受到廣泛關(guān)注?，F(xiàn)已證明：水楊酸不僅可以調(diào)節(jié)植物的某些生長發(fā)育過程，還能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性，抵抗不良因素造成的傷害。 水楊酸與β胡蘿卜素近年來，國內(nèi)外對(duì)杜氏鹽藻的培養(yǎng)條件和β胡蘿卜素的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了大量的研究，研究發(fā)現(xiàn)鹽藻的最適生長條件和β胡蘿卜素最適積累條件存在很大的差異，一般在高鹽度、強(qiáng)光、營養(yǎng)饑餓等條件下，鹽藻能夠大量積累β胡蘿卜素，但此條件下不適于鹽藻的生長；而在最適的生長條件下，β胡蘿卜素又無法大量的積累。為了解決這一矛盾，周世水等進(jìn)行了二步法培養(yǎng)的研究，即在鹽藻的生長階段和β胡蘿卜素的積累階段采用不同的培養(yǎng)方法，以獲得最大的β胡蘿卜素產(chǎn)量。目前，對(duì)利用鹽藻生產(chǎn)β胡蘿卜素的研究主要集中于外界條件這一層次上，如鹽度、光照強(qiáng)度、溫度、營養(yǎng)液等。而外源激素水楊酸對(duì)鹽藻β胡蘿卜素積累研究很少。水楊酸作為一種植物激素，主要的研究集中于高等植物。本文初步研究了不同濃度的水楊酸對(duì)鹽藻生長和物質(zhì)積累的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)，低濃度（1mg/L）的水楊酸對(duì)鹽藻的生長具有一定的促進(jìn)作用；高濃度（5mg/L、10mg/L）的水楊酸前期對(duì)細(xì)胞的生長具有一定的促進(jìn)作用，后期具有明顯的致死作用。在一定范圍內(nèi)。較低濃度的水楊酸對(duì)色素的積累具有一定的促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)中1mg/L的水楊酸促進(jìn)作用最明顯，可以明顯加快色素的積累進(jìn)程。在色素積累過程中，鹽藻總可溶性蛋白含量的變化規(guī)律與藻細(xì)胞生長趨勢基本保持一致。第二章 材料與方法第二章 材料與方法 杜氏鹽藻的培養(yǎng) 藻種 杜氏鹽藻原藻種購自中國海洋大學(xué) 藻種培養(yǎng)在5L三角瓶內(nèi)裝3L液體培養(yǎng)基，接種一定體積的原藻液，且接種細(xì)胞為分裂能力較強(qiáng)的綠色游動(dòng)細(xì)胞。由日光燈提供照明，12h/12h光暗周期照明，光強(qiáng)為1000Lx，恒溫下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20℃。每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶35次，直至培養(yǎng)到生長對(duì)數(shù)期。后繼續(xù)轉(zhuǎn)移到250mL的培養(yǎng)瓶中進(jìn)一步擴(kuò)增，其中移入的液體培養(yǎng)基為80mL，藻液為20mL，總體積為100mL。隨著藻細(xì)胞密度的增大，搖瓶次數(shù)增加到58次。以防止藻細(xì)胞貼壁生長，以培養(yǎng)出較多量的綠色游動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用 MCM培養(yǎng)基，其中各營養(yǎng)成分濃度如下：（一）大量元素：KNO3 NaCL 150g/L（二）微量元素H3BO3 5H2O 60μg/LCoCL6H2O 51μg/L MnCL24H2O 41μg/L(NH4)6Mo7O244H2O （三）螯合鐵溶液Na2EDTA FeCL36H2O 實(shí)驗(yàn)材料 藥品與試劑 水楊酸、牛血清白蛋白、蒸餾水、95%乙醇、丙酮、飽和食鹽水、85%濃磷酸 PH PBS：25mL KH2PO4+ NaOH 加水稀釋定容至100mL考馬斯亮藍(lán)G250：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G250溶于50mL90%乙醇中，加入85%濃磷酸100mL，最后用蒸餾水定容至1000mL。常溫下可保存一月 儀器 冰箱、血球計(jì)數(shù)板、三角瓶（250mL、4L）、比色皿、量筒、容量瓶、膠頭滴管、蓋玻片、細(xì)線、封口膜、pH試紙、玻璃棒、藥匙、移液槍等電子天平（HANGPING FA1004）可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司723型）超聲波破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司 CV33）超速離心機(jī)（TGL—16G）臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（HERMLE Z323K）臺(tái)式低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠 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