【文章內(nèi)容簡介】 制睪丸甾酮與硫的結(jié)合，造成I相代謝物和排泄物的積累，進(jìn)而激活了組織中的雄性激素所造成的。（三） TBT抑制細(xì)胞色素P450芳香化酶脊椎動(dòng)物體內(nèi)性激素的合成和轉(zhuǎn)化，先由膽固醇（Cholesterol）經(jīng)一系列步驟轉(zhuǎn)變?yōu)樾巯┒ˋndrostenedione）或睪丸激素(Testosterone，也稱睪丸甾酮)，后者再被轉(zhuǎn)化成雌激素酮（Estrone）或雌二醇（Estradiol），這一過程由細(xì)胞色素P450芳香化酶（Cytochrome P450 aromatase）催化，因此它被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物體內(nèi)雌激素生物合成的最后一步限速酶。雌激素和雄激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相近，其生物合成途徑也相似，雌、雄性體內(nèi)均存在此兩類激素，僅兩者比例不同。因此其生物合成過程中任何一步發(fā)生差錯(cuò)都將導(dǎo)致體內(nèi)激素水平的升高或降低，進(jìn)而使生物生理特征發(fā)生改變。目前對(duì)無脊椎動(dòng)物激素系統(tǒng)的了解很少，但已知某些軟體動(dòng)物含有與脊椎動(dòng)物同樣的類固醇激素，其形成途徑也與脊椎動(dòng)物相似。因此令人聯(lián)想到TBT是否通過抑制固醇類激素合成過程中酶的作用，而使雄烯二酮或睪丸甾酮不能轉(zhuǎn)化成雌激素酮或雌二醇，使雄性激素在體內(nèi)大量積累，最終導(dǎo)致軟體動(dòng)物性畸變和雌雄間性現(xiàn)象。圖11 激素合成簡圖 Brief scheme of biosynthesis of hormones魚類實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)非類固醇芳香化酶抑制劑處理的雌性幼魚能發(fā)育成具有雄性特征的魚，因而得到啟示：當(dāng)無芳香化酶抑制劑時(shí)，雄激素可被芳香化酶催化轉(zhuǎn)化為雌激素，雌激素抑制雄性特征產(chǎn)生。軟體動(dòng)物類固醇作用機(jī)理和魚類的相似，因而認(rèn)為軟體動(dòng)物芳香化酶被抑制后也會(huì)產(chǎn)生類似魚類那樣的性別轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。Spooner等提出了TBT抑制芳香化酶而致腹足類動(dòng)物性畸變的假設(shè)。他們將正常成年雌性螺狗巖螺置于含TBT液體中養(yǎng)42d，結(jié)果雌螺長出了陰莖，定期檢測發(fā)現(xiàn)螺體內(nèi)孕酮和17β雌二醇水平無顯著變化，而睪酮濃度卻在28d后顯著提高。一般睪酮與孕酮水平是互相制約的，孕酮水平?jīng)]有變化，那么睪酮水平發(fā)生的變化不可能是甾體生物合成中的一般規(guī)律所能解釋的。他們認(rèn)為TBT的作用使芳香化酶催化睪酮轉(zhuǎn)化17β雌二醇的過程受阻，睪酮積累引起雄性化現(xiàn)象。為了證實(shí)提高睪酮含量會(huì)導(dǎo)致性畸變的推測，Spooner分別將不同劑量的睪酮注入成年雌性螺狗巖螺體內(nèi)，然后在無污染的海水中暫養(yǎng)42d，、其中注入劑量較高的兩組雌螺的陰莖長度顯著增加。以后Spooner等的工作被德國研究人員進(jìn)一步證實(shí)。其中Bettin等將兩種雌性螺(Nucella lapillus和Nucella reticulatus)置于12～244ng/L TBT環(huán)境下養(yǎng)5～6個(gè)月，2個(gè)月內(nèi)被處理的兩種動(dòng)物都產(chǎn)生了性畸變現(xiàn)象，睪酮水平也顯著提高；他們還發(fā)現(xiàn)２種不同螺性畸變程度有微弱差別，分析是由于動(dòng)物體內(nèi)雄激素受體量有所不同，對(duì)TBT的反應(yīng)有所差別。這一推測解釋了為什么生活于同樣TBT污染環(huán)境下，有些種類軟體動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)性畸變而有些種類則沒有。雖然對(duì)性畸變現(xiàn)象機(jī)理的解釋還沒有完全定論，但多數(shù)人可以接受的解釋為：正常個(gè)體中，較高含量的三丁基錫或許能競爭性地抑制細(xì)胞色素P450芳香化酶的活性，由此阻止了雄烯二酮或睪丸甾酮向雌激素酮或雌二醇的轉(zhuǎn)化，結(jié)果前者的量累積、升高，導(dǎo)致體內(nèi)激素水平失去平衡，誘發(fā)生理病變，到達(dá)一定程度便表現(xiàn)為性畸變現(xiàn)象?！〖?xì)胞色素P450酶系簡介細(xì)胞色素是一類以鐵卟啉為輔基的結(jié)合蛋白質(zhì)，通過分子中鐵化學(xué)價(jià)的變化，在細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)中傳遞電子。迄今已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞色素有十多種，依其光譜特征（即還原型細(xì)胞色素的吸收率）分為a、b、c三族?！〖?xì)胞色素P450酶系又稱細(xì)胞色素P450芳香化酶（Cytochrome P450 aromatase）、加單氧酶（monooxygenase）、多功能氧化酶（Mixed Function Oxygenase，MFO）等，是一古老的基因超家族產(chǎn)物。它廣泛存在于不同生物體內(nèi)各種組織和細(xì)胞內(nèi)，. ，并執(zhí)行多種生理功能，如在碳同化、激素合成、外源物質(zhì)降解、前致癌物的活化等。近年來該領(lǐng)域已成為國際學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)之一?！〖?xì)胞色素P450酶系的基本特征細(xì)胞色素P450酶系實(shí)際上是一類具有不同分子量、不同生化和免疫學(xué)特征以及不同催化能力的血紅素蛋白的總稱，它們所主導(dǎo)的生物轉(zhuǎn)化過程是一個(gè)復(fù)雜的連鎖酶促反應(yīng)過程，催化的典型反應(yīng)是通過電子傳遞系統(tǒng)將分子氧還原，并將其中的一個(gè)氧原子加到底物中，反應(yīng)需要NADPH：RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+。細(xì)胞色素P450酶系由多種組分組成，包括：兩種細(xì)胞色素（細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素b5）、兩種黃素蛋白（NADPH－細(xì)胞色素 P450還原酶和NADH－細(xì)胞色素b5還原酶）以及磷脂等[29]。細(xì)胞色素P450是50年代中期Williams等發(fā)現(xiàn)、60年代初Omura等驗(yàn)證的一類b族細(xì)胞色素，由于還原型細(xì)胞色素的血紅素鐵接受電子被還原后能與CO結(jié)合，其產(chǎn)物在光譜450nm處具最高吸收峰，被命名為細(xì)胞色素 P450。它是細(xì)胞色素P450酶系主要組分，為滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的結(jié)合蛋白。細(xì)胞色素P450都具有一非共價(jià)結(jié)合的血紅素和環(huán)繞半胱氨酸的26個(gè)氨基殘基保守序列，半胱氨酸提供血紅素鐵的第五個(gè)配體（ligand）。它主要分布于動(dòng)物肝、肺、腎、鰓、皮膚、消化道、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)、生殖器官等組織?！?duì)細(xì)胞色素P450的幾點(diǎn)認(rèn)識(shí)①　細(xì)胞色素P450基因是個(gè)古老基因超家族，它們?cè)从?5億年前的同一祖先；②古P450與生物在無氧條件下獲得能量有關(guān)，以過氧化酶方式保護(hù)細(xì)胞免遭活性氧作用；③P450早期功能為同化環(huán)境中化合物，以抵御其對(duì)機(jī)體的傷害；部分高等生物已不具備此功能；④P450家族中成員都具有甾醇代謝功能；⑤P450具有代謝內(nèi)源物質(zhì)和外來物兩大功能[29～32]?！》诸惻c命名細(xì)胞色素P450酶命名以英文縮寫CYP表示，后面跟有數(shù)字、字母、數(shù)字，分別代表家族、亞家族和同工酶。斜體表示P450基因或cDNA，正體代表基因產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)。P450酶系分子量約為40～60kDa，至少15%氨基酸序列相同。根據(jù)P450氨基酸序列的相似性將P450歸于不同的家族或亞家族，同一基因家族成員蛋白質(zhì)序列大于40％的氨基酸殘基是相同的，而把相同氨基酸數(shù)大于55％的細(xì)胞色素P450歸為同一亞家族。1985年成立了國際細(xì)胞色素P450基因命名委員會(huì)，對(duì)克隆基因進(jìn)行規(guī)范化命名。用大寫CYP表示細(xì)胞色素P450基因，下設(shè)不同的家族（Family），用3表示，家族下設(shè)亞家族（Subfamily），用英文字母A、B…表示，亞家族由多個(gè)基因成員組成用4……表示，有的基因有幾個(gè)等位基因，用小寫v表示，等位基因間在v后加阿拉伯?dāng)?shù)字加以區(qū)分，整個(gè)名稱的表示如CYP6B4v1。到目前為止，已克隆了504個(gè)P450基因，分屬70個(gè)家族，127個(gè)亞家族，其中哺乳動(dòng)物分屬14個(gè)家族，6個(gè)亞家族，無脊椎動(dòng)物屬10個(gè)家族，低等真核生物11個(gè)家族（CYP51CYP62），細(xì)菌19個(gè)家族，30個(gè)亞家族，植物屬CYP71CYP90。　CYP1CYP4細(xì)胞色素P450超家族的研究主要包括人類、鼠類、昆蟲等。人類的大部分家族及功能都已研究（表11）。海洋生物中魚類的研究較多，有CYPCYPCYPCYP4等，海洋無脊椎動(dòng)物CYP家族則研究得較少，主要有CYP4家族，甲殼類的CYPCYP45，軟體動(dòng)物的CYPCYP10等[34～36]。國內(nèi)細(xì)胞色素P450酶系的研究多數(shù)集中在人和鼠類，也有對(duì)昆蟲P450酶系某些家族的研究，但并未見有海洋無脊椎動(dòng)物P450基因研究的報(bào)道。表11 人類CYP家族及其主要功能Table11 Human CYP families and their main functions. [37]CYP familyMain functionsCYP1CYP2CYP3CYP4CYP5CYP7CYP8CYP11CYP17CYP19CYP21CYP24CYP26CYP27CYP39CYP46CYP51Xenobiotic metabolismXenobiotic metabolism Arachidonic acid metabolismXenobiotic and steroid metabolismFatty acid hydroxylationThromboxane synthesisCholesterol 7αhydroxylationProstacyclin synthesisCholesterol sidechain cleavage Steroid 11β hydroxylation Aldosterone synthesisSteroid 17αhydroxylationAndrogen aromatizationSteroid 21hydroxylationSteroid 24hydroxylationRetinoic acid hydroxylationSteroid 27hydroxylationUnknownCholesterol 24hydroxylationSterol biosynthesis＊Xenobiotic為異生物質(zhì)，指環(huán)境污染的外來化學(xué)制劑，如農(nóng)藥（殺蟲劑、除草劑）、多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯、鹵代烴、鹵代芳烴和合成染料等[339]?！〖に睾铣膳cCYP19雄激素是膽固醇合成雌激素的中間產(chǎn)物，芳香化酶是體內(nèi)合成雌激素過程的重要酶系，是雄激素轉(zhuǎn)變成雌激素的限速酶。其中包括細(xì)胞色素P450超家族中的CYP19，由CYP19基因編碼，其復(fù)合物可氧化脫去雄激素的19－甲基，使雄激素變成雌激素，其活性高低決定體內(nèi)雌激素水平。人類CYP19與乳腺癌等疾病的產(chǎn)生有關(guān)。人為造成編碼芳香化酶CYP19基因突變或缺失的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，出現(xiàn)芳香化酶缺失或功能改變，不能產(chǎn)生雌激素，稱為ArKO模型。此模型老鼠有生理或病理特征，如生殖能力下降和肥胖癥等[40～42]。鱷魚性別不是由遺傳機(jī)制決定的，是由其卵孵化溫度決定。Willow N .G. 研究美洲鱷魚（Alligator mississippiensis）雌胚和雄胚時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者CYP19基因的表達(dá)在晶胚熱敏感期(TSP)前無顯著差異，但CYP19基因的表達(dá)及雌激素的產(chǎn)生在TSP后的卵巢的分化上起重要作用[43]。Tzchori對(duì)歐洲鰻（Anguilla anguilla）性別決定的研究發(fā)現(xiàn)，芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor，AI）既能減少幼魚體內(nèi)雌二醇合成，還使CYP19基因的表達(dá)水平降低[44]。硬骨魚性別表型可以通過改變晶胚孵育的溫度、幼魚飼養(yǎng)的溫度及性激素水平等方法而發(fā)生變化。遺傳上為雌性（XX）的日本比目魚（Paralichthys olivaceus）幼魚在18℃水溫飼養(yǎng)30－100天，成魚將是雌性；而在27℃下飼養(yǎng)后，成魚將是雄性。T. Kitano等對(duì)此比目魚（XX）的P450芳香化酶基因CYP19的cDNA進(jìn)行研究，并對(duì)其進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)50天后（還未產(chǎn)生性別分化時(shí)）雌雄兩組間該基因mRNA水平并無差異；然而，飼養(yǎng)60天后（開始出現(xiàn)性別差異時(shí)），雌魚組該基因mRNA水平迅速增加，雄魚組輕微減少；同時(shí)，雌魚組17－β雌二醇含量顯著增加，而雄魚組則保持不變[45]。此外，CYP19也會(huì)影響雌雄魚類的繁殖能力和性行為。鑒于以上事實(shí)及本課題的研究對(duì)象疣荔枝螺存在性畸變現(xiàn)象，我們希望在此方面進(jìn)行探索性研究，尋找疣荔枝螺體內(nèi)是否存在CYP19基因，以期探討性畸變現(xiàn)象的分子機(jī)制。 CYP4CYP4為P450基因家族中的重要成員，在脊椎動(dòng)物中參與脂肪酸的ω羥基化、脂肪酸衍生物的氧化和前列腺素代謝等，這些物質(zhì)均參與相關(guān)性激素代謝。已發(fā)現(xiàn)昆蟲（如果蠅、蚊子、棉花蟲等）CYP4對(duì)殺蟲劑等化學(xué)藥品有抵抗作用。有研究認(rèn)為蟑螂體內(nèi)的CYP4C與保幼激素（juvenile hormone，JH）生物合成有關(guān)。1998年，Mark J. Snyder首次報(bào)道，海洋無脊椎動(dòng)物中存在有CYP4家族。Snyder對(duì)５種海洋無脊椎動(dòng)物消化組織的研究，發(fā)現(xiàn)小蝦（Penaeus setiferus）有CYP4C16，鮑魚（Haliotis rufescens）有CYP4C17，龍蝦（Homarus americanus）有CYP4C18，海膽（Lytechinus anamesis）有CYP4C1CYP4C20，貽貝（Mytilus galloprovincialis）有CYP4Y1。他還發(fā)現(xiàn)貽貝CYP4Y1基因表達(dá)因萘黃酮（βnaphthoflavone）濃度升高而被抑制，進(jìn)而會(huì)影響體內(nèi)的其它代謝。他提出海洋軟體動(dòng)物CYP4的表達(dá)會(huì)因化學(xué)藥品而改變，而螺體內(nèi)睪丸激素代謝也因TBT濃度的增加而改變，兩者間存在一定聯(lián)系。另外，體內(nèi)CYP4 mRNA水平及P450酶活性降低程度可作為軟體動(dòng)物受異生物質(zhì)（xenobiotic）影響大小的生物標(biāo)記物（biomarkers，即能反映生物系統(tǒng)和潛在危害之間的聯(lián)系）。綜上所述，已經(jīng)證明了部分海洋軟體動(dòng)物含有CYP4，為此，我們希望對(duì)性畸變指示生物━疣荔枝螺進(jìn)行這方面的探索研究，為搞清性畸變分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)?！〖?xì)胞色素P450基因CYP的克隆策略P450基因可以通過有目的、有針對(duì)性地采取適當(dāng)?shù)牟呗钥寺〕鰜韀447]：①　從研究對(duì)象中分離和純化特定目的P450蛋白，以此為抗原制備單克隆或多克隆抗體，用于篩選同物種的cDNA表達(dá)文庫，從中分離和調(diào)出目的P450基因cDNA。其主要優(yōu)點(diǎn)是，可得到全序列P450 cDNA；可以有針對(duì)性地克隆特定功能P450基因。缺點(diǎn)是P450含量低、易失活，且制備抗體費(fèi)時(shí)。②　從研究對(duì)象中分離純化特定P450蛋白，并對(duì)其肽鏈末端和內(nèi)部的氨基酸序列進(jìn)行分析，根據(jù)已知的氨基酸序列設(shè)計(jì)針對(duì)性極強(qiáng)的引物，進(jìn)行PCR或RT－PCR擴(kuò)增，用擴(kuò)增片段為探針，對(duì)cDNA文庫或基因組文庫進(jìn)行篩選，釣出特定的P450基因。用PCR