【文章內(nèi)容簡介】 GL16A，上海菲恰爾分析儀器有限公司電熱恒溫水浴鍋 DKS24，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司可調(diào)式移液器 Finnpipette，芬蘭超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) JY92II，寧波新芝生物科技股份有限公司滅菌鍋 TOMYSX500，日本漩渦混合器 WH966，上?？等A生化儀器制造有限公司熒光酶標(biāo)儀 BioTeK FLX800，中國熒光顯微鏡 NikonTE2000U，日本振蕩培養(yǎng)箱 HZQX100，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司生化培養(yǎng)箱 PHX150H，寧波萊?？萍加邢薰境瑑艄ぷ髋_(tái) SWCJ1FD，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司酶標(biāo)儀 1020，鄭州安圖生物工程有限公司（1） 主要試劑。. 主要試劑名稱產(chǎn)地DABsigmaDCFHDASigmaDHE SigmaGSHSolarbioHoechst33342Solarbio3MASigmaMitotrack greenSolarbioNACSolarbioNBT SigmaRhodamine123SigmaTris Bio Basic IncTTCSolarbio牛血清白蛋白（BSA） sigma蛋白胨OxoidL甲硫氨酸北京鼎國生物有限公司酵母浸膏Oxoid考馬斯亮藍(lán)G－250Solarbio 葡萄糖北京鼎國生物有限公司鹽酸 洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司乙二胺四乙酸二鈉Solarbio95%乙醇 洛陽化學(xué)試劑廠 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基配方1) YPD培養(yǎng)基① YPD液體培養(yǎng)基酵母浸膏1 g蛋白胨2 g葡萄糖2 g混勻后 蒸餾水定容至 100 ml② YPD固體培養(yǎng)基：含1%瓊脂的YPD液體培養(yǎng)基2) 發(fā)酵培養(yǎng)基酵母抽提物 g蛋白胨 g硫酸銨 g磷酸二氫鉀 g硫酸鎂 g氯化鈣 g葡萄糖 25 g混勻后 定容至250 ml 蛋白含量測定試劑配方1）考馬斯亮藍(lán)G250溶液 考馬斯亮藍(lán)G250100 mg95% 乙醇50 ml85% 磷酸100 ml混勻后 蒸餾水定容至 1 000 ml2）1mg/ml牛血清白蛋白(BSA) BSA1 mgH2O1 ml4℃保存1）5 mmol/L DCFHDA儲(chǔ)存液：DCFHDA g二甲基亞砜（DMSO）500 μl使用時(shí)每1 ml細(xì)胞加4 μl2）10 mg/ml DHE儲(chǔ)存液：DHE5 mg二甲基亞砜（DMSO）500 μl使用時(shí)每1 ml細(xì)胞懸浮液加4 μl3）1 mg/ml PI儲(chǔ)存液：碘化丙啶1 mgH2O1 ml使用時(shí)每1 ml細(xì)胞懸浮液加4 μl1）雷帕霉素（rapamycin） Ethanol mlRapamycin 40 μgTritonX100 ml 使用時(shí)每1 ml細(xì)胞加50 μl2）100 mM 3甲基腺嘌呤（3MA）3MA100 mg二甲基亞砜DMSO ml分裝，20℃下保存 實(shí)驗(yàn)方法 生長情況檢測 本實(shí)驗(yàn)室從安琪酵母粉中提取的釀酒酵母。挑單菌落于YPD培養(yǎng)基中于180 rpm，30℃下培養(yǎng)至對數(shù)期制成種子液，按1%接種量接種于新鮮YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期（OD=）后，加入相應(yīng)的試劑處理一定時(shí)間，按不同的指標(biāo)測定作相應(yīng)的處理。按以下不同處理設(shè)置實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理3個(gè)平行。CK：蒸餾水 5% E：5%（v/v） 無水乙醇10% E：10%（v/v）無水乙醇5% E+GSH：5%（v/v）無水乙醇+ mM GSH10% E+GSH：10%（v/v）無水乙醇+ mM GSH5% E+Met：5%（v/v） 無水乙醇+6 mM GSH10% E+Met：10%（v/v） 無水乙醇+6 mM GSH5% E+NAC：5%（v/v） 無水乙醇+10 mM GSH10% E+NAC：10%（v/v） 無水乙醇+10 mM GSH5% E+3MA：5%（v/v） 無水乙醇+5 mM GSH10% E+3MA：10%（v/v） 無水乙醇+5 mM GSH5% E+Rapa：5%（v/v） 無水乙醇+10 mM GSH10% E+Rapa：10%（v/v） 無水乙醇+10 mM GSH 粗裂解酶液的制備根據(jù)需要取不同處理釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，12000 g，4 ℃離心5分鐘，收集菌體。得到的菌體重懸于同體積的無菌去離子水中洗滌兩次，置于冰上超聲波破碎300秒（60次，每次5秒，間隔5秒），得裂解液。 點(diǎn)菌落實(shí)驗(yàn)取各處理酵母細(xì)胞懸液，分別稀釋101,102,103,104,105,106倍，各取2 μl滴加到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，30℃下倒置培養(yǎng)2 d，拍照觀察各處理下菌落形態(tài)。：本實(shí)驗(yàn)采用Bradford法測定蛋白含量[30]，具體方法如下：1）蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按下表順序依次加入各試劑： 蛋白質(zhì)含量測定所加試劑表管號1234561mg/ml BSA(ml)0蒸餾水(ml)10考馬斯亮藍(lán)G250(ml) 555555充分混勻，10 min后于595 nm下測定光吸收值。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)595為縱坐標(biāo)，作圖，即得蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A595值，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。 圖 存活率測定 取不同處理的酵母細(xì)胞，用平板計(jì)數(shù)法測定存活率。取各處理酵母細(xì)胞懸液，分別稀釋101,102,103,104,105,106倍，取100 μl適宜梯度的稀釋液均勻傾注到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基上，30℃下倒置培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)。 酒精含量測定1)密度瓶質(zhì)量的測定 將密度瓶洗凈、干燥、反復(fù)稱重，直至恒重，記錄密度瓶質(zhì)量 (m)。 2)蒸餾水質(zhì)量的測定 將蒸餾水注滿已恒重的密度瓶，插上帶溫度計(jì)的瓶塞（瓶中無氣泡），立即浸于 20℃的高精度恒溫水浴中，保持 15～20 min，待整體溫度達(dá)到20℃后取出，用濾紙吸去溢出支管的水，蓋好小帽，取出密度瓶，立即擦干后稱重，記錄密瓶和水的質(zhì)量 (m1)。 3）蒸餾液的測定 將第二步中測定過的密度瓶內(nèi)的水倒去，用蒸餾得到的蒸餾液沖洗密度瓶 2～3 次，然后裝滿蒸餾液，按 第二步中的操作處理，記錄密度瓶和酒樣蒸餾液的質(zhì)量（m2） 。 結(jié)果計(jì)算 按下式計(jì)算試樣餾出液在 20℃時(shí)的密度： 式中：ρ20—酒樣餾出液在 20℃時(shí)的密度，g/L； m ——密度瓶的質(zhì)量，g； m1 ——20℃時(shí)密度瓶與充滿密度瓶蒸餾水的總質(zhì)量，g； m2 ——20℃時(shí)密度瓶與充滿密度瓶酒樣餾出液的總質(zhì)量，g； ρ0 —20℃時(shí)蒸餾水的密度， g/L； A—空氣浮力校正值； ρa(bǔ) —干燥空氣在 20℃、 hPa 時(shí)的密度值，約為 g/L（該值隨氣壓條件略有變化，但這種變化一般對密度測定沒有影響）； —在 20℃時(shí)蒸餾水與干燥空氣密度值之差，g/L。取不同處理釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml，10 000 g，4 ℃離心5分鐘，收集菌體。得到的菌體重懸于同體積的無菌去離子水中洗滌兩次，每毫升細(xì)胞懸液加入 10 μl 10 mgml? 1 PI，室溫黑暗處理10 min，取100 μl液體加入酶標(biāo)板中用熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度。 H2O2含量測定 參考Du Xiaoyi等人[31]的方法，采用DCFHDA法測定H2O2含量。具體方法如下：取不同處理釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液1 ml，10 000 g，4 ℃離心5分鐘，收集菌體。得到的菌體重懸于同體積的無菌去離子水中洗滌兩次，使用 2′,7′dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFHDA。 SigmaAldrich)測定胞內(nèi)H2O2，25℃下用20 μmol/L DCFHDA于暗處孵育經(jīng)過處理的 1107細(xì)胞/ml，使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)光 485/14 nm，發(fā)射光535/25 nm下測定熒光強(qiáng)度，熒光顯微鏡下用藍(lán)色濾光片觀察拍照。 O2含量測定（DHE法）參考Ayer Anita等人[32]的方法，具體方法如下：取不同處理釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液1 ml，10 000 g，4 ℃離心5分鐘，收集菌體。得到的菌體重懸于同體積的無菌去離子水中洗滌兩次，使用DHE 測定胞內(nèi)O2水平。使用DHE（dihydroethidium。 終濃度 5 mg/ml）30℃ 染色20 min后，用去離子水沖洗，重懸后在熒光顯微鏡下用藍(lán)色濾光片觀察）。 O2含量測定（NBT法）胞內(nèi)的NBT(硝基藍(lán)四唑)可被超氧陰離子甲基化成藍(lán)色，從而可以用來測定ROS的產(chǎn)生。參考Zhang Hui等人[33]的方法，具體方法如下：酵母細(xì)胞在30℃下用50 181。mol/L NBT孵育15 min，用無水乙醇固定，空氣干燥。接著用960 181。L 2 mol/L的KOH和1120 μL的DMSO溶解，測定630 nm下的吸光度。采用硫代巴比妥法測定MDA膜脂過氧化水平。具體方法如下：取不同處理釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)液5 ml，12000 g，4 ℃離心5分鐘，收集菌體。得到的菌體重懸于同體積的無菌去離子水中洗滌兩次。超聲波破碎取上清，即為待測酶液， ml，然后各加入2 ml %的硫代巴比妥酸（TBA，用5%的三氯乙酸配制，現(xiàn)配現(xiàn)用）?；旌暇鶆蚝蠓兴性?5 min；然后使試管在冰浴中迅速冷卻，高速冷凍離心機(jī)上以10 000 rpm，離心10 min，取上清分別測定450 nm，532 nm和600 nm下光吸光值。根據(jù)如下公式計(jì)算MDA含量。MDA(mmolg1FW)=[(A532－ A600) －A450]Vt/Vs/FW A450—— 450 nm下的吸光值A(chǔ)532 ——532 nm下的吸光值A(chǔ)600——600 nm下的吸光值 Vt —— 提取液總體積（ml） Vs —— 測定時(shí)提取液體積（ml）FW ——菌體鮮重（g） 參考Wang Juan等人[34] 的方法，采用羅丹明123（Rhodamine 123，Rh123）測定線粒體膜電位變化。酵母細(xì)胞在含有指定試劑的YPD培養(yǎng)基中處理一定時(shí)間。2 μM Rh123中室溫下孵育30 min，接著用蒸餾水沖洗重懸。采用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為480和530 nm下測定Rh123的熒光強(qiáng)度。并用熒光顯微鏡拍攝照片。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，所得數(shù)據(jù)均以平均值177。SD表示，用SPSS做t測驗(yàn)。P ，用*表示， P ，用**表示。第三章 結(jié)果與分析 乙醇對釀酒酵母生長發(fā)育的影響 不同濃度乙醇對釀酒酵母存活率的影響。取對數(shù)期釀酒酵母在含有不同濃度無水乙醇的YPD培養(yǎng)基中處理一定時(shí)間。平板梯度稀釋法測定細(xì)胞存活率，涂有不同濃度梯度酵母細(xì)胞的YPD固體平板于30176。C下孵育72 h，記菌落數(shù)。所有值均為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值177。標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3）。Fig. . Effects of differnent concentration of ethanol on the viability of cells. Cell were grown in YPD meidium until midlog phase and treated with water, 5% ethanol or 10% ethanol. Cell viability was determined by standard dilution plate counts on solid YPD medium. The plates were incubated at 30176。C for 72 h and the colonies were counted. Each rectangle represents the mean 177。SE of three replicates (n=3). 活化后生長至對數(shù)期的釀酒酵母菌株分別在含有0，5 %和10%無水乙醇的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，隔1小時(shí)取一次樣，采用平板計(jì)數(shù)法測定菌落數(shù)。，乙醇處理的酵母存活率均低于對照，并且隨著乙醇濃度的增加，生長抑制越明顯，10%乙醇處理組細(xì)胞存活率在三個(gè)小時(shí)內(nèi)幾乎不變。 不同濃度乙醇對釀酒酵母菌落生長的影響。取不同濃度無水乙醇處理一定時(shí)間的對數(shù)期釀酒酵母，按10倍梯度稀釋過后，各取2 μl點(diǎn)在YPD固體培養(yǎng)基上，將點(diǎn)有不同濃度梯度酵母細(xì)胞