【文章內容簡介】 ，為東鄉(xiāng)野生稻中優(yōu)異基因的有效挖掘與利用提供有用的信息。2 材料與方法 以東鄉(xiāng)野生稻(O. rufipogon Griff.)為供體親本,與栽培稻協青早B(O. sativa sp．indica Kato.)雜交獲得種間雜種F1,F1與協青早B回交獲得BC1F1群體。BC1F1經單粒傳、再連續(xù)自交8次后獲得含228個株系的BC1F9 BILs群體。本實驗所用材料包括東鄉(xiāng)野生稻漸滲系后代BC1F中國水稻品種及國外水稻品種（表1）。表1 實驗材料Table 1 Materials used in the experiment品種 Cultivars名稱 name漸滲系后代IL533IL524IL1IL5IL11IL12IL14IL18IL15IL1ILIL22IL533ILIL1IL3IL8IL75中國水稻空育13哈0密陽4金23B、珍汕97B、南京6號、臺農1號、測6桂9谷梅4號、日本晴、TP30稻花香、XB國外水稻 K12 、trenasse 、wells 、Bengal 、Lemont 、R15 、242cocodrie、Ronolo、Katy、della、tempheton、francis、dellrose 實驗方法 模板DNA的制備所有材料在長至三葉一心時期取幼嫩的葉片,采用改良的CTAB法提取水稻基因組DNA[26], 具體步驟如下:（1）取3~5 g水稻幼嫩的葉片剪碎放入研缽中,加液氮充分研磨至粉碎,適量分裝至2 mL離心管中,裝1/3左右。 （2）每管加入1 mL 65℃預熱的提取液(CTAB),上下顛倒混勻,置65℃水浴鍋中溫育30~60 min, 隔10 min顛倒混勻一次。（3） 取出室溫放置5 min冷卻, 加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1), 緩慢上下顛倒混勻。（4） 室溫下12,000 rpm 離心10 min (溫度不低于15℃)，重復抽提2次。（5） 吸取上清液約600 mL 離心管中,加入等體積的預冷的異丙醇, 輕輕混勻(沉淀DNA)后20℃冰柜下2h或過夜。（6） 4℃下10,000 rpm離心10 min, 棄上清, 加入800 μL 70%乙醇漂洗, 10,000 rpm離心5 min, 棄去乙醇溶液, 重復漂洗一次。（7） 棄上清,自然晾干后,將沉淀的DNA溶于600 μL 的TE溶液中,放常溫下完全溶解。加入5 μL不含DNase的RNaseA(終濃度為100μg/mL),37℃保溫2 h。（8） 然后于離心管中加入600 μL氯仿:異戊醇(24:1), 輕輕上下顛倒混勻10 min 后12,000 rpm離心10 min, mL 的離心管中先后加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH=)和兩倍體積預冷的無水乙醇,置20℃冰柜中。（9） 2 h后10,000 rpm離心10 min,棄上清,之后用70%乙醇漂洗(8000 rpm,5min, 4℃),自然晾干后,最后DNA溶解于100 μL滅菌的ddH2O中,20℃保存?zhèn)溆谩＃?0）待DNA完全溶解以后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量,根據DNA marker估計其溶度,調整溶度后的DNA置于20℃保存?zhèn)溆谩?基因組DNA酶切用限制性內切酶EcoRI和 MseI (NEB) 進行酶切反應,反應體系如下: DNA 300ng 10T4 ligase Buffer EcoRI （20 U/μL） MseI （20 U/μL） ddH2O Up to 注:酶切反應前,先將DNA、10T4 ligase Buffer、ddH2O混勻,4℃放置30min后,加入內切酶,混勻、低速離心數秒,37℃溫浴。 EcoRI 接頭序列為：5’CTCGTAGACTGCGTACC3’ 3’CATCTGACGCATGGTTAA5’ MseI 接頭序列為：5’GACGATGAGTCCTGAG3’ 3’TACTCAGGACTCAT5’ 用 T4 DNA ligase（TaKaRa）進行連接反應，體系如下： DNA 酶切產物 EcoRI 接頭（5pmol/μl） MseI 接頭（50pmol/μl） 10T4 ligase Buffer T4DNA ligase（5U/μl） ATP（10mM） Mg2+（25 mM） ddH2O 將上述反應物混勻離心數秒,37℃保溫過夜,65℃/10 min,20℃保存?zhèn)溆谩?預擴增反應體系如下： DNA 酶切連接產物 10PCR Buffer Mg2+（25mM） dNTP（ mM） Taq 聚合酶（5U/μl） EcoRI +0（5 μmol/μLl） MseI +0（5 μmol/μL） ddH2O 混勻離心數秒后，進行PCR預擴增，程序為：（ 94℃/1 min。 56℃/1 min。 72℃/1 min, 35個循環(huán), 72℃/10 min ） Step 1 94℃ 1min Step 2 94℃ 1min Step 3 56℃ 1min Step 4 72℃ 1min Step 5 to Step 2 35 cycles Step 6 72℃ 10min Step 7 End4℃保存?zhèn)溆谩ｎA擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測,根據彌散帶亮度確定其濃度,用ddH2O稀釋適當倍數后(約15倍)用于選擇性擴增模板。 選擇性擴增根據在耐冷漸滲系后代中具有活性增高的Ty1copia類逆轉座子houba、osr15和osr17的LTR區(qū)域設計[27]，本實驗設計了4條逆轉座子特異性引物, SSAP所用引物系列見表2。表2 SSAP 預擴增和選擇性擴增引物序列 Table 2 Preamplification and selective amplification primer sequences used in SSAP 預擴增引物 Primers for preamplificationEcoRI +0539。GACTGCGTACCAATTC339。MseI +0539。 GATGAGTCCTGAGTAA 339。 選擇性引物 Primers for selective amplificationLTR of osr15539。GGTGTCTTTCTATTATCCCTTAT339。 Combined with MseI +CTC and EcoRI+TCLTR of osr171539。TGGTCACAACCCTAAATCCT339。Combined with MseI +CTCLTR of osr172539。CGACTGGTCACAACCCTAA339。Combined with EcoRI + TCLTR of houba539。GCGTGTTTCGTGCCTTCG339。Combined with EcoRI +TC,AA,TT and TG反應體系如下： DNA 酶切連接產物 10PCR Buffer MgCl2（25 mmol/L） dNTP（ mM） Taq 聚合酶（5U/μl） 接頭引物（5 μmol/μL） LTR引物（5 μmol/μL）