【正文】 21符號表 22致謝 23I摘 要逆轉(zhuǎn)座子的高拷貝數(shù)特點和穩(wěn)定的遺傳特性使其在分子標記領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力,高等植物中的逆轉(zhuǎn)座子主要屬于Ty1copia類,基于其LTRs的SSAP已成為最有用的分子標記技術(shù)之一。結(jié)果擴增得到140條條帶，進一步分析可以將這些條帶分為6個家族,東鄉(xiāng)野生稻后代幾乎分布于每個家族中。表明漸滲雜交能夠擴大現(xiàn)有栽培稻的變異度,為水稻遺傳改良提供有效的途徑。在過去十年, 研究者開發(fā)了各種各樣的分子標記用于研究LTR逆轉(zhuǎn)座子的插入位點, 如序列擴增多態(tài)性(SSAP)。東鄉(xiāng)野生稻具有許多優(yōu)異基因，但其漸滲過程中會導(dǎo)致許多遺傳和表觀遺傳上的改變[4]，如染色體結(jié)構(gòu)的變異、序列的丟失和出現(xiàn)、以及LTR逆轉(zhuǎn)座子活性的改變。許多植物的進化歷程中都含有漸滲雜交的足跡。 漸滲雜交可激活沉默的轉(zhuǎn)座元件 在植物和真菌基因組中, 轉(zhuǎn)座元件多數(shù)情況下是處于抑制狀態(tài)[7]?？傊瑥囊陨涎芯靠梢钥闯?，遠緣雜交可激活基因組中沉默的轉(zhuǎn)座元件，這很可能是遠緣雜交打破了基因組內(nèi)部表觀遺傳抑制控制（如甲基化狀態(tài)的改變）的結(jié)果。根據(jù)長末端重復(fù)序列（long terminal repeat, LTR）的有無，逆轉(zhuǎn)座子可分為LTR 逆轉(zhuǎn)座子和nonLTR 逆轉(zhuǎn)座子兩類。根據(jù)pol基因的同源性以及排列順序，LTR逆轉(zhuǎn)座子又可分為Ty1copia和Ty3gypsy兩類。 prot: protease。 PBS: primer binding site。在一般情況下，逆轉(zhuǎn)座子以靜止狀態(tài)存在于植物中，但部分逆轉(zhuǎn)座子仍具有轉(zhuǎn)座潛能，能夠被各種生物和非生物脅迫所激活如包括原生質(zhì)體分離、組織培養(yǎng)、外傷、茉莉酸甲酯（MeJA）和水楊酸（SA）等非生物脅迫能夠大大提高Tnt1和Tto1逆轉(zhuǎn)座子的表達[15]。LTR不編碼蛋白質(zhì)，但含有對轉(zhuǎn)座起重要作用的啟動和終止信號。 SSAP是由Waugh等根據(jù)AFLP標記而改進的一種基于逆轉(zhuǎn)座子LTR序列的錨定的AFLP技術(shù)，用于檢測逆轉(zhuǎn)座子插入位點與鄰近限制性酶切位點之間的 DNA 多態(tài)性（圖2）。SSAP擴增的多態(tài)性來源主要有以下三個：第一是限制性位點及其兩側(cè)序列的變異；第二是LTR 5’末端的變異；第三是逆轉(zhuǎn)座子插入位點的變異。利用BARE1的反向重復(fù)序列區(qū)設(shè)計的SSAP引物被應(yīng)用于小麥四倍體、大麥品種之間的遺傳多態(tài)性分析以及親緣關(guān)系系統(tǒng)樹的構(gòu)建,且通過SSAP標記發(fā)現(xiàn)了一些常規(guī)圖譜發(fā)現(xiàn)不了的品種間的隱秘變異[23]。作為栽培稻的祖先，野生稻是一個天然的基因庫，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、強耐冷、抗旱、抗多種病蟲害等優(yōu)良特性，前人的研究表明野生稻比栽培稻具有更高的遺傳多樣性，因此，將野生優(yōu)異基因轉(zhuǎn)入到栽培種中，是擴大水稻遺傳基礎(chǔ)和實現(xiàn)水稻遺傳改良的重要途徑，已經(jīng)成為國內(nèi)外育種家孜孜不倦的追求目標。一方面是因為野生種中存在不良連鎖基因和不利農(nóng)藝性狀，加上所有平衡群體中野生種中不利基因高頻的出現(xiàn)、基因互作的增加、微效多基因效應(yīng)被掩蓋等缺點；另一方面，外源基因漸滲會導(dǎo)致受體植物出現(xiàn)廣泛的遺傳和表觀遺傳變化，因而在基因組和表型上表現(xiàn)出許多不穩(wěn)定現(xiàn)象，如丟失親本序列或出現(xiàn)新序列；轉(zhuǎn)座子活性等。BC1F1經(jīng)單粒傳、再連續(xù)自交8次后獲得含228個株系的BC1F9 BILs群體。（3） 取出室溫放置5 min冷卻, 加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1), 緩慢上下顛倒混勻。（7） 棄上清,自然晾干后,將沉淀的DNA溶于600 μL 的TE溶液中,放常溫下完全溶解。（10）待DNA完全溶解以后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量,根據(jù)DNA marker估計其溶度,調(diào)整溶度后的DNA置于20℃保存?zhèn)溆谩?56℃/1 min。表2 SSAP 預(yù)擴增和選擇性擴增引物序列 Table 2 Preamplification and selective amplification primer sequences used in SSAP 預(yù)擴增引物 Primers for preamplificationEcoRI +0539。 選擇性引物 Primers for selective amplificationLTR of osr15539。Combined with MseI +CTCLTR of osr172539。Combined with EcoRI +TC,AA,TT and TG反應(yīng)體系如下： DNA 酶切連接產(chǎn)物 10PCR Buffer MgCl2（25 mmol/L） dNTP（ mM） Taq 聚合酶（5U/μl） 接頭引物（5 μmol/μL） LTR引物（5 μmol/μL） ddH2O 選擇性擴增程序為：（一輪循環(huán)94℃/30 s, 65℃/30 s, 72℃/60 s, ℃, 擴增11個循環(huán)。具體步驟如下:（1） 玻璃板的準備: 將長、短玻璃板徹底清洗干凈并晾干, 用75%乙醇分別擦拭長、短玻璃板3遍。灌膠后用夾子夾緊,放置4 h以上或者過夜。 SSAP條帶的顯色SSAP條帶顯色主要參照《現(xiàn)代分子生物學技術(shù)》(第二版)(盧圣棟,1999), 稍作改動:（1） 固定: 電泳結(jié)束后,撬開板,將附著凝膠的長板浸在固定液(10%乙醇, %冰醋酸)中,輕搖固定5 min。（4） 終止: 將顯影液倒出,凝膠重新放入固定液中,固定5 min。各遺傳參數(shù)和遺傳距離利用軟件GENALEX （Principal coordinate analysis, PCA）和貝葉斯（Bayesian）中的聚類方法來分析。從表中可以看出，poppop2以及pop3的平均Nei39。 Ne，有效等位基因數(shù)。Note: Na, number of alleles。 I, Shannon39。正如圖所示, 栽培稻的親緣關(guān)系較近，東鄉(xiāng)野生稻漸滲系分布于每一個家族中。說明東鄉(xiāng)野生稻漸滲栽培稻導(dǎo)致后代IL116的逆轉(zhuǎn)座子產(chǎn)生較大的變異。盡管漸滲雜交是利用野生有利基因的有效途徑, 但在漸滲過程中會導(dǎo)致許多遺傳和表觀遺傳上的改變，如染色體結(jié)構(gòu)的變異、序列的丟失和出現(xiàn)、LTR逆轉(zhuǎn)座子活性的改變。本研究所利用的SSAP引物是根據(jù)具有活性的LTR逆轉(zhuǎn)座子houba、osr15和osr17設(shè)計的，而這種漸滲系后代的遺傳多樣性以及高變異度是否由這三類逆轉(zhuǎn)座子的激活引起的還不得而知，且這三類逆轉(zhuǎn)座子在后代中活性的增高對野生稻向栽培稻的進化是否也具有一定的影響及何種影響還有待驗證。再次致上我無限的謝意和感激！。從老師身上，我學到的不僅僅是豐富的專業(yè)知識，更學到了嚴謹?shù)目茖W態(tài)度。說明其LTR逆轉(zhuǎn)座子插入位點及其附近序列變異最大。本研究利用SSAP分子標記對比分析了漸滲系后代與栽培稻之間的遺傳結(jié)構(gòu)及多樣性,結(jié)果顯示，漸滲系后代的平均遺傳多樣性高于栽培稻，PCA分析結(jié)果也顯示漸滲系后代的變異度較栽培稻大，這些研究結(jié)果與前人利用SSR、AFLP分子標記得到的研究結(jié)果相一致。而東鄉(xiāng)野生稻漸滲系幾乎在6類中都具有分布，表明漸滲系群體是研究水稻馴化的很好的材料。說明漸滲系雜交過程增加了后代的遺傳變異度。 He, Nei39。s基因多樣性；I，Shannon39。說明中國和外國的栽培稻遺傳多樣性非常接近，而東鄉(xiāng)野生稻漸滲系后代的遺傳多樣性則要高于栽培稻。之后利用5對引物組合對這46個材料進行SSAP分析,共擴增出140條條帶，每一條條帶為一個擴增位點。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計沒有條帶擴增出來記為“0”，擴增出目的條帶的記為“1”。將凝膠從染色液中取出,放入蒸餾水中短暫漂洗(約5~10 s)。（4） 電泳:上下層電泳緩沖液都為1TBE,電泳之前清洗點樣孔3遍。（2） 6%凝膠配制及灌膠: ,待尿素完全溶解后加入40%PA膠貯液9 mL,10TBE 6 mL,ddH2O定容到60 mL,充分混勻后,過濾。 擴增產(chǎn)物的檢測 變性聚丙烯酞胺膠電泳選擇性擴增產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE膠,含6%丙烯酰胺, %N,N39。Combined with EcoRI + TCLTR of houba539。 Combined with MseI +CTC and EcoRI+TCLTR of osr171539。MseI +0539。預(yù)擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進行檢測,根據(jù)彌散帶亮度確定其濃度,用ddH2O稀釋適當倍數(shù)后(約15倍)用于選擇性擴增模板。 EcoRI 接頭序列為：5’CTCGTAGACTGCGTACC3’ 3’CATCTGACGCATGGTTAA5’ MseI 接頭序列為：5’GACGATGAGTCCTGAG3’ 3’TACTCAGGACTCAT5’ 用 T4 DNA ligase（TaKaRa）進行連接反應(yīng)，體系如下： DNA 酶切產(chǎn)物 EcoRI 接頭（5pmol/μl） MseI 接頭（50pmol/μl